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       【摘要】 
       目的探讨丹参对MMP-2，TIMP-1，TGF-β1和IV-C在糖尿病大鼠肾脏中表达的调节及其与糖尿病肾脏病变的关系。方法SD大鼠随机分成正常组、模型组、对照组和观察组，每组10只。用高糖高脂饲料刺激、加小剂量STZ诱导2型糖尿病大鼠模型，于第16周末处死大鼠，免疫组织化学的方法检测各组大鼠肾组织中MMP-2，TIMP-1，TGF-β1和IV-C的表达，RT-PCR法检测各组大鼠MMP-2，TIMP-1mRNA的表达，同时检测血糖、尿蛋白及肾功能等。结果对照组、观察组与模型组比较，TGF-β1，TIMP-1和IV-C的表达显著减少（P<0.05），MMP-2的表达显著增高(P<0.05)，MMP-2，TIMP-1mRNA的表达与组化结果一致。同时，MMP-2及IV-C表达的改变分别与尿蛋白排泄率升高有显著相关性(P<0.05)。结论肾组织中的MMP-2，TIMP-1，TGF-β1和IV-C的表达改变与糖尿病肾脏病变有关，丹参通过影响上述指标的变化对DN的治疗产生作用。
       【关键词】  糖尿病肾损害； 细胞外基质； 丹参； 转化生长因子； 金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制因子
       Effect  of  Salvia miltiorrhiza  on the Expression of on  MMP-2，TIMP-1，TGF-β1 and IV-C  of  Rats with Dibetic Nephropathy
       HU Bo, LI Feng*，WANG Yanwu，CHEN Bingxue，WANG Zhenguo，LI Junyong
       （Bethune Military Medical College, Shijiazhuang 050081, China; FMMU University,Xijing Hospital, Xi"an 710032,China; The 260 th Hospital of PLA, Shijiazhuang  050041, China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of Salvia miltiorrhiza on the expression of MMP-2,TIMP-1,TGF－β1 and IV-C in Kidney of rats with diabetes and its relationship with diabetic nephropathy( DN). MethodsSD rats were randomly divided into normal control group, model group, treatment group and observation group, with 10 rats in each group. The type II diabetic rat model was constructed by employing high glucose and lipid, and low dose STZ, and the animals were sacrificed at the end of 16th week. Immunohistochemistry was adopted to detect the expression of MMP-2,TIMP-1,TGF－β1 and IV-C in renal tissues, meanwhile, serum glucose, urine protein and renal function were also evaluated.ResultsCompared with the treatment group and observation group, the expression of TGF－β1，TIMP-1 and IV-C significantly decreased(P＜0.05）, but MMP-2 expression increased(P<0.05). At the same time, the changes of MMP-2 and IV-C expression were significantly correlated with urine protein excretion.ConclusionThe expression of TIMP-1,TGF－β1 and IV-C are related to DN,Salvia miltiorrhiza has protective effect on DN through affecting the changes of above mentioned indexes.
       Key words：Kidney damage with dibetes patients;   Extracellular matrix;   Salvia miltiorrhiza ;   Transforming growing factor;   Matrix metallo proteinases/ tissue inhibitors of matrix metalloproteinases
       
       糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）最常见的微血管并发症，是糖尿病患者主要的死亡原因之一。DN的基本病变是细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)在肾小球、肾小管积聚导致肾小球基底膜增厚和系膜基质增多，出现结节型与弥漫型肾小球硬化，前者是DN特异性病理损害。本研究观察丹参对STZ实验性糖尿病肾损害大鼠肾脏金属蛋白酶2（MMP-2）、金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）、转化生长因子1（TGF-β1）和IV型胶原蛋白水平的表达、尿白蛋白排泄率的改变，旨在探讨MMP-2、TIMP-1、TGF-β1和IV-C与DN功能和形态学改变的关系以及丹参的调节效应,为丹参防治DN临床应用与开发提供依据。
       1  材料
       
       　　丹参（西京医院药剂科中药制剂室煎制）：按成人剂量的10倍，水煎浓缩至稠膏每克含生药5.1 g，按5.5 g/kg(体重)1次/d灌胃，4℃冰箱贮藏备用。格列吡嗪(美吡达)片：海南赞邦制药有限公司生产，规格5 mg／片，批号：050201，购于第四军医大学附属西京医院药房，将药物捣碎后用蒸馏水溶解，配成0．5 g/L浓度，按5 mg／kg(体重)剂量1次/d灌胃。
       2  方法
       2.1  实验动物分组和DM模型的建立选取4周龄雄性SPF级SD大鼠［第四军医大学实验动物中心提供，合格证号：（SCXK(军)2002-005)］60只，体重为(165±12.5)g， 随机选出10只为正常组。DM模型的制备，剩余的50只大鼠在高糖高脂饮食1个月诱导胰岛素抵抗后，给予亚致病剂量(30 mg／kg) 链脲佐菌素STZ(Sigma公司产品)注射，以0．1 mol／L，pH 4.2的无菌枸橼酸钠缓冲液稀释，按30 mg／kg体重单次尾静脉注射,诱导糖尿病的发生。该模型具有中度高血糖、高血脂、胰岛素抵抗以及典型的糖尿病肾病改变等特点［1］。以注射后1个月血糖值持续高于7.8 mmol／L，尿糖阳性者为DM模型建立成功，共选出糖尿病动物30只（成模率为60％），随机分到模型组，对照组和观察组3个组中，每组10只。
       2.2  动物的给药及饲养灌胃剂量按大鼠用药剂量为人的10倍计算。对照组：灌服格列吡嗪5 mg·kg-1·d-1；观察组：每日灌服丹参5.5 g·kg-1·d-1。正常组和模型组灌服等体积的蒸馏水。实验期间，所有动物在同一条件下，室温保持在20～24℃，相对湿度40％。正常组动物标准饮食，自由饮水，模型组、对照组、观察组动物给予高糖高脂饮食，自由饮水。
       2.3  实验标本的收集至第16周末，用25%乌拉坦麻醉大鼠，打开腹腔,从腹主动脉取血，充分暴露两侧肾脏，将1/2的肾脏迅速放入4％多聚甲醛中固定，用于石蜡切片。余下的1/2用消毒铝箔包好迅速放入液氮中，保存于-80℃冰箱中，备用于PCR样本的提取。
       2.4  检测指标
       2.4.1  生化指标血糖采用罗氏公司(ROCHE)的优越血糖仪(ACCU－CHEK ADVANTAGE)测定；血肌酐采用苦味酸法；尿蛋白用双缩脲法，根据24 h尿量计算尿蛋白排泄率。
       2.4.2  肾组织免疫组织化学染色(试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司)按试剂盒操作步骤进行,以SABC法检测。一抗为1：20O稀释的Rabbit anti- MMP-2（或1∶100的TIMP-1、TGF-β1和1∶300的Ⅳ-C）。细胞浆中呈现棕黄色颗粒为阳性反应，图像采用Miaspro图像分析系统进行分析。
       2.4.3  免疫组织化学染色图像分析大鼠肾组织上出现棕黄色物质为阳性，应用Miaspro图像分析系统进行免疫组化图像分析。所有切片放大倍数为1 000×。每组取6只动物，每只动物MMP-2，TIMP-1，TGF-β1，IV-C染色各取2张切片，观察3个视野。视场面积为480 000 mm2，测定阳性面积比［Aa(%)］(阳性面积／视野面积)。
       2.5  统计学处理计量资料以 ±s表示，采用SPSS10.0统计软件，进行方差分析，组间用q检验；行相关分析。P<0．05表示有统计学意义。
       3  结果
       3.1  各组动物的一般情况与生化指标变化DM组大鼠均出现多饮、多食、多尿，早期体重不同程度的有所增加，8周后一般情况变差，体重下降，消瘦，毛发失去光泽，后期出现腹胀。对照组和观察组动物一般情况较好，“三多一少”症状较模型组明显减轻，皮毛较为光泽，没有观察到腹胀。血糖、24 h尿蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮正常组、观察组和对照组比模型组都有明显降低。见表1。
       表1  实验大鼠的一般情况与生化指标（略）
       与模型组比较，▲P＜0.01,*P＜0.05；n=10
       3.2  肾组织免疫组织化学染色图像分析MMP-2的免疫组化染色：在正常组肾组织中有明显的MMP-2的表达，在肾小球、肾小管及间质可见明显棕黄色强阳性染色区；模型组MMP-2仅为弱阳性表达。IV-C在正常组肾组织中可见少量棕黄色染色；在模型组，TGF-β1、IV-C表达即明显增多，在肾小球、肾间质中均可见大量棕黄色染色，IV-C表达强阳性。TIMP-1在肾脏主要表达于肾小球系膜细胞、内皮细胞、上皮细胞。模型组TIMP-l蛋白表达高于正常组 (P<0.05)。经过治疗后对照组、观察组MMP-2较模型组有明显上升（P<0.05），TIMP-1，TGF-β1，IV-C有明显下降（P<0.05）。见表2及图1。
       表2  MMP-2、TIMP-1，TGF-β1，IV-C的表达（略）
       与模型组比较，*P＜0.05；n=10
       3.3  逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
       3.3.1  总RNA提取采用一步法提取总RNA（试剂盒购自TaKaRa公司），取200 mg肾组织提取总RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度，RNA浓度=（OD260 nm-OD280 nm）×稀释倍数×0.04 μg/μl，并用OD260/OD280计算RNA污染程度R，R应在1.8～2.0之间。
       3.3.2  RNA浓度计算RNA浓度=A260值×40 μg／ml×50。
       3.3.3  RT(逆转录)MMP-2，TIMP-1引物(由宝生物工程大连有限公司合成)。TIMP-1引物序列：上游：5"-TTTGCATCTCTG GCCTCTG-3" ，下游：5"-AATGACTGTCACTCTCCAG-3"； MMP-2引物序列：上游5"-CACCATCGCCCATCATCA-3"，下游5"一TGGATTCGAGAAAAGCGCAGC一3"，β-actin引物合成：上游：5"-CCTTCCTGGGTATGGAATCCT-3" ，下游：5"-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3" 。
       3.3.4  cDNA逆转录反应加入试剂含25mM  Mgcl2  2μl，10×RT Buffer 1 μl，RNase Free dH2O 3.75 μl、dNTP  Mixture（各10mM） 1 μl，RNase Inhibitor（40 U/μl） 0.25μl，AMV Reverse Transcriptase（5U /μl） 0.5 μl，特异性下游引物 20pmol 0.5μl，提取总RNA样本1.0 μl作为模板，总体积10μL，反应条件为42℃ 30 min，95℃ 5 min，5℃ 5min一个循环，-20℃保存备用。
       3.3.5  扩增半定量多聚酶链反应反应条件95℃ 预变性3min，94℃  45 s，60℃  40 s，72℃  45 s  30个循环，最后一个循环72℃延伸3 min。扩增结束后20g/L琼脂糖凝胶检测，紫外灯下观察结果并拍照保存，BIO-RAD凝胶成像分析系统(BIO-RAD公司)采集图像并进行分析。PCR检测结果以经β-actin校正后的A值表示。Mark为TaKaRa公司的DNA Mark DL 2000。
       图1  MMP-2免疫组化染色（略）
       3.4  各组动物肾组织MMP-2，TIMP-1 mRNA的表达RT-PCR产物电泳结果显示: 正常组大鼠肾脏MMP-2 mRNA的表达明显高于模型组,两者分别为（0.89±0.031）和（0.58±0.027） (P< 0.01)，观察组（0.64±0.033）明显高于模型组( P< 0.05)；正常组大鼠肾脏TIMP-1 mRNA的表达明显低于模型组,两者分别为（0.51±0.015）和（0.82±0.030 ）( P< 0.01)，观察组（0.68±0.027）明显低于模型组( P< 0.05)。见表3及图2。
       3.5  相关分析相关分析表明，MMP-2的表达与尿蛋白排泄率呈显著负相关(r=0.612 5，P<0．05)；而IV-C表达则与尿蛋白排泄率呈显著正相关(r=0.732 5，P<0.05)。
       表3  MMP-2和TIMP-1mRNA的表达（略）
       与模型组比较，▲P＜0.01,*P＜0.05；n=10
       图2  大鼠肾脏TIMP-1 mRNA的检测结果表达（略）
       4  讨论
          
       丹参可降低Ⅳ期DN患者空腹血糖、尿蛋白排泄率、血尿素氮、血肌酐，改善患者水肿、全身乏力、便干等症状，疗效肯定［2］。本研究结果显示丹参能显著降低观察组大鼠血糖、尿蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮等指标，动物表现为皮毛光泽，体重稳定，“三多一少”症状明显减轻，进一步证实丹参对糖尿病肾病的保护作用。
       
       DN的特点是肾基底膜增厚和系膜区为主的细胞外基质(ECM)积聚，导致弥漫性或结节性肾小球硬化，出现蛋白尿、水肿、高血压、肾功能衰竭［3］等 。而基底膜和ECM主要由胶原、纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）和蛋白多糖构成，在胶原成分中，最重要的是Ⅳ型胶原［4］。基质金属蛋白酶(MMPs)是主要的ECM降解酶，其中MMP-2的主要作用底物是IV-C。正常情况下，ECM 生成和降解保持动态平衡，MMPs和TIMPs是构成这种重要的调控系统之一。体外实验表明，将鼠肾脏系膜细胞置于高糖介质中培养5 d即有MMPs活性的显著降低［5］。最近，Mclennan SV等［6］在DM 大鼠模型肾组织中也发现MMP-2活性降低43％。有研究发现，有微量蛋白尿的DM病人，其尿中IV-C水平明显增高［7］。TIMPs为MMPs家族的天然抑制因子，二者的相对水平对ECM 降解有重要意义。持续高血糖可通过某种机制上调TIMP-1，下调MMP-2表达，改变体内MMP-2和TIMP-1相对水平，从而阻碍ECM 降解，导致肾组织结构和功能改变［8］。TGF-β表达上调是影响MMPs／TIMPs系统和ECM 降解的另一重要机制［5］，作为多种代谢和血流动力学因素导致ECM 积聚的共同中介，TGF-β被认为是MMPs最重要的调控因子。研究表明，多数MMPs基因启动区含TGF-β抑制物元件(TIE)和AP-1结合序列，高血糖时TGF-β表达上调可直接作用于TIE和间接通过c-fos／JunB异二聚体对AP-1结合序列的作用，下调MMPs基因表达。本实验结果显示：TGF-β可上调TIMPs表达，抑制MMPs的活性，从而减少ECM 的降解。MMP-2和TIMP-1，TGF-β1表达失衡导致IV-C表达增加和／或降解减少可能是DN发生发展的重要因素。丹参治疗能显著升高糖尿病大鼠组织中的MMP-2蛋白表达，因此我们推测丹参对糖尿病大鼠肾脏的保护作用可能与升高MMP-2，降低TIMP-1，TGF-β1，IV-C和改善细胞外基质的表达有关。  
       
       祖国医学所认识的消渴病日久出现的“水肿”“胀满”“尿浊”“关格”与现代医学的糖尿病肾病的临床症状相似。研究证实丹参［9］（丹参之脂溶性成分丹参酮，水溶性成分丹参素、原儿茶醛、丹参酚酸B）能增加肾血流、有利尿和抗炎作用，可降低血BUN，SG调节肾组织局部微循环，改善肾功能，同时具有轻度抑制凝血系统与增强纤溶活性作用，降低血小板粘附和纤维蛋白原。以上药理效应为丹参临床药效取得提供了可靠的保证。
       
       丹参对ECM的降解的有效化学成分及其作用机理有待进一步深入研究。
       【参考文献】
         ［1］ 郭啸华，刘志红，李 恒，等．实验性2型糖尿病大鼠模型的建立［J］．肾脏病与透析移植杂志，2000，9：351．
       
       ［2］ 李 锋，王汉民，行 利，等.泽黄颗粒治疗糖尿病肾病38例临床观察［J］. 中国中医药信息杂志，2005，12（10）：64.
       
       ［3］ 林善琰.重视糖尿病肾脏病变的临床诊断和治疗［J］．中华内分泌代谢杂志，1998，12(2)：65
       
       ［4］ Febre J．Ballant LP．The kidney in maturity-onset diabetes mellitus：a clinical study on 510 patients［J］. Kidney Int，1982．21:730.
       
       ［5］ Singh R，Song Rh，Alavi N，et al，High glucose decreases matrix metalloproteinase-2 activity in rat mesangial cells via transforming growth factor-betal［J］．Experimental nephrology，2001，9(4)：249.
       
       ［6］ Mclennan SV，Kelly DT，Cox AJ，et a1．Decreased matix degradation in diabetic nephropathy：efects of ACE inhibition on the expression and activities of matrix metalloproteinases［J］．Diabetologia，2002，45(2)：268.
       
       ［7］ Kotajima N，Fukumura Y，Obata S U，et a1．The significance of determination of uriary type IV Colagen concentrations from a random urine in patients with non-insulin dependent diabetes mellitus［J］．Rinsho Byori，1998，46(3)：277.
       
       ［8］ 肖 谦，汪恕萍，郭建增.金属蛋白酶－2和金属蛋白酶组织抑制物－1与糖尿病肾病关系的实验研究［J］.中国糖尿病杂志,2003,11(3):192.
       
       ［9］ 李 锋，李晓苗，王汉民，等.化瘀利水法治疗糖尿病肾病中医临床机制分析［J］.中国中西医结合肾病杂志，2005，6（l1）：673.