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       【摘要】 
       目的探讨当归对缺氧损伤的体外培养心肌细胞的保护作用。方法将乳鼠心肌细胞原代单层培养至4～5 d，制备心肌缺氧模型后，加入当归水提取物，继续培养12 h后，组织化学染色方法观察PAS反应、琥珀酸脱氢酶及酸性磷酸酶的变化；透射电镜观察心肌细胞的形态学变化；生化检测方法测定SOD活性、MDA含量。结果与模型对照组比较，实验组及药物对照组心肌细胞的PAS反应和SDH活性明显增强，ACP活性明显减弱；SOD活性明显增强，MDA含量明显降低；心肌细胞的线粒体损伤得到明显修复。结论当归对缺氧心肌细胞具有抗氧化作用；当归对缺氧心肌细胞具有一定的保护作用。
       【关键词】  当归； 心肌细胞； 缺氧
       当归为伞形科(Umbrelliferae)植物的干燥块根，药性甘、辛、温，入肝、心、脾经，具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠等功效［1］。 当归中含有19种氨基酸，23种微量元素及维生素A、维生素B、磷脂等物质［2］。 本实验利用培养心肌细胞制作心肌缺氧损伤模型，应用生化检测及组织化学、电镜观察等方法，探讨了当归对培养心肌细胞缺氧性损伤的保护作用及其作用机制，为当归的临床应用提供理论依据。
       1  材料
          
       Wistar系大鼠乳鼠，3～5 d龄，由延边大学医学部实验动物科提供。当归水提取物：由延边大学药学院天然药物化学教研室提取，用于实验时用RPMI1640培养液配成0.7，0.5，0.3 mg/ml剂量，经筛选0.5 mg/ml为最适宜浓度。RPMI1640培养基（GIBCO公司）；胰蛋白酶（DIFCO公司）；新生灭活小牛血清（北京华美生物工程公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
       2  方法
       2.1  心肌细胞的原代单层培养与“缺氧”损伤模型的制备心肌细胞的培养采用姜玉顺［3］建立的原代单层培养方法。培养心肌细胞“缺氧”损伤模型，参考车成日［4］建立的方法制备。
       2.2  实验分组及处理取生长良好的培养瓶，随机分为4组。正常对照组：定时更换正常培养基培养；模型对照组：更换N2饱和缺氧培养基培养；药物对照组为N2饱和缺氧培养基加0.5 g/L人参皂苷培养；实验组为N2饱和缺氧培养基加0.5 g/L当归水提取物培养。将各组均置于37℃ ，二氧化碳培养箱内培养12 h。
       2.3  检测指标
       2.3.1  组织化学指标测定取出各组培养瓶内的生长细胞盖玻片，进行PAS反应显示糖原，用酶组织化学方法显示琥珀酸脱氢酶（SDH）及酸性磷酸酶（ACP）,并用OLYMPUS万能显微镜观察并拍片分析。
       2.3.2  生化指标测定实验各组各取15支培养瓶，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，采用TB法测定MDA含量，采用芬兰MK-3型酶标仪测吸光度。
       2.3.3  透射电镜标本制备及检测经离心取沉淀的培养心肌细胞，用0.1 mol/L磷酸缓冲液洗3次，2.5%戊二醛，1%锇酸分别固定30 min，以递增浓度的丙酮脱水，EPON定向包埋，37℃，45℃，60℃分别聚合12 h，24 h，36 h，用LKBV型切片机切成5 μm切片，醋酸铀和枸缘酸铅染色，JEM120EX透射电镜观察并拍片。
       2.4  统计学处理数据采用±s表示，应用SPSS 11.5统计软件进行方差分析。
       3  结果
       3.1  组织化学结果实验组及药物对照组心肌细胞PAS反应均比模型对照组反应明显增强，实验组及药物对照组心肌细胞 SDH活性与模型对照组相比活性明显增强，实验组及药物对照组心肌细胞ACP活性与模型对照组相比活性明显减弱。
       3.2  透射电镜观察结果模型对照组心肌细胞质内，线粒体肿胀，嵴断裂，双层膜结构不清，粗面内质网脱颗粒，高尔基复合体囊腔塌陷，变细。实验组心肌细胞及药物对照组的心肌细胞内上述变化均得到明显恢复，即线粒体双层膜与线粒体嵴清晰可见，高尔基复合体呈扁平囊状，粗面内质网上核糖体排列清楚。结果见图1～2。
       图1  模型对照组心肌细胞超微结构（12 000×） （略）         
       图2  实验组心肌细胞超微结构（12 000×）（略）
       
       3.3  生化检测结果实验组及药物对照组心肌细胞SOD活性明显高于模型对照组 （P<0.01），MDA含量明显低于模型对照组（P<0.01）。结果见表1～2。
       表1  当归对缺氧培养心肌细胞SOD活性的影响（略）
       与模型对照组比较，* P<0.01；n=15
       表2  当归对缺氧培养心肌细胞MDA含量的影响（略）
       与模型对照组比较，* P<0.01；n=15
       4  讨论
          
       心肌细胞在缺氧条件下，会出现一系列的变化，包括形态学、功能活动、细胞代谢改变及胞浆内的酶自细胞内到外漏出等［5］。自由基性质具有极强的氧化反应能力，对人体有很大的危害性。SOD为直接清除自由基的酶，可阻断自由基促使产生LPO的链式反应，从而保护细胞不受自由基的损害。本实验测定了SOD活性及MDA含量，结果表明当归具有抗自由基损伤的作用。
       
       实验组心肌细胞糖原含量与模型对照组相比明显增多，SDH活性明显增强，ACP活性明显减弱，以及透射电镜结果均表明当归对缺氧培养心肌细胞的形态结构及功能具有一定的保护作用。
       
       本实验研究表明当归能抑制心肌细胞超氧自由基的生成，提高清除自由基的能力，减缓心肌细胞受自由基的攻击，避免了脂质过氧化反应对心肌细胞的损害，明显地改善了缺氧对心肌细胞的损伤，有效地保持了缺氧培养心肌细胞内膜性结构的完整性，使损伤心肌细胞酶活性、超微结构的形态变化均得以基本恢复正常。
       【参考文献】
         　［1］ 徐国钧，何宏贤，徐珞珊，等.中国药材学［M］. 北京：中国医药科技出版社，1996：332.
       
       ［2］ 中国医学科学院药物研究所.中草药现代研究（第2卷）［M］. 北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1996：6.
       
       ［3］ 姜玉顺.体外培养心肌细胞的初步观察［J］. 延边医学院学报，1982，5（2）：75.
       
       ［4］ 车成日，金基焕，崔苍海，等.缺氧缺糖后再给氧给糖对培养心肌细胞膜糖蛋白变化的影响［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，1994，3（4）：357.
       
       ［5］ 李维祖，李卫平，尹艳艳.黄芪总苷及黄芪甲苷对糖皮质激素诱导衰老大鼠氧自由基代谢的影响［J］. 中国中药杂志，2007，35（3）：65.