文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的对地锦草提取物进行体外抗真菌实验，测定其最小抑菌浓度(MIC)值。方法采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)，测定地锦草提取物对60株临床常见皮肤癣菌的MIC。参考MIC结果，选取地锦草提取物敏感的6株皮肤癣菌按文献方法进行杀菌试验。结果地锦草提取物对红色毛癣菌的MIC范围为128～1 024 μg·ml-1，平均MIC为446 μg·ml-1；对石膏样毛癣菌的MIC范围为128～1 024 μg·ml-1，平均MIC为539 μg·ml-1。杀菌结果显示，6株皮肤癣菌均生长，表明地锦草具有抑菌作用，其抗真菌作用是通过抑制真菌生长而发挥作用的，而不具有杀菌作用。结论地锦草提取物体外实验对真菌的生长具有抑制作用。
       【关键词】  地锦草提取物； M38-A方案； 体外抗真菌； 最低抑菌浓度
       Study on Antifungal Susceptibility of Dijincao Extract against Dermatophytes
       LI Zhijian， Gulnar·Dawuti，  Silafu·Aibai*
       （Shihezi University , Shihezi 832000, China；Xinjiang Uighur Medical Hospital, Urumqi 830049, China；Institute of Xinjiang Uighur Medicine, Urumqi 830049, China)
       Abstract：ObjectiveTo examine the antifungal effect of Dijincao extract in vitro and to measure the minimum inhibitory concentration(MIC). MethodsAccording to the standard approved by the National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS) : Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi(M38-A), the MICs of Dijincao extract against 60 strains of common clinical dermatophytes were determined.According to those MICs, 6 strains of dermatophytes being sensitive to Dijincao extract were selected, and germicidal test was conducted according to the method in documents. ResultsThe MIC range of Dijincao extract against Trichophyton rubrum was 128～1 024μg·ml-1，mean MIC was 446μg·ml-1；the MIC range of Dijincao extract against Trichophyton mentagrophytes was 128～1 024μg·ml-1，mean MIC was 539μg·ml-1. The result of germicidal test showed that all the 6 strains of dermatophytes grew. ConclusionDijincao extract has antifungal activity against the dermatophytes in vitro.
       Key words：Dijincao extract;   M38-A;   Antifungal in vitro;   MIC
       
       地锦草，维吾尔名为夏塔热其尼（Xiahatereqini）、雅丽蔓（Yalmankulake），为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.或斑地锦Euphorbia maculata L.的干燥全草，是维吾尔医常用药材，临床主要用于治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病［1］。研究发现，地锦草提取物具有抗细菌作用，但其抗真菌方面的研究和文献报道较少。为了研究地锦草提取物的体外抗真菌的作用，我们参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)［2］，探讨地锦草提取物的体外抗真菌活性。
       1   材料
       1.1   药物地锦草提取物(DJC)，由自治区维吾尔医药研究所药剂室提供。提取方法及质量控制，参照《中华人民共和国药品标准-维吾尔药分册》中百癣夏塔热片之地锦草提取方法及质量控制［3］。阳性对照药特比萘酚(Terbinafine，TBF，商品名：Lamisil)，由诺华公司提供，批号010482，纯度99.9%。
       1.2   菌种红色毛癣菌(Trichophyton rubrum，T.r)20株；石膏样毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes，T.m)40株；质量控制菌株为近平滑念珠菌(Candida parapsilosis，C.p)1株。本实验所采用的菌株，均来自新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库(XYZ)。
       1.3   培养基RPMI-1640培养基，美国sigma公司产品；三氮吗啡琳丙磺酸（MOPS），美国sigma公司产品；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，批号20070825，北京奥博星生物科技有限公司产品。
       
       RPMI-1640培养基的配制：将10.4 g RPMI-1640和34.53 g MOPS粉末溶于900 ml蒸馏水中，用1 mol·L-1 NaOH溶液调整其pH至7.0(25 ℃)，加蒸馏水定容至1 L，G-6漏斗滤过灭菌，存于4 ℃冰箱备用。
       
       PDA培养基的配制：称取PDA 粉末38 g，加入1 000 ml蒸馏水中，摇匀加热煮沸溶解，121℃高压灭菌20 min，分装，4 ℃保存，备用。
       2  方法
       2.1  MIC的测定根据NCCLS推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)［2］，测定DJC提取物对T.r、T.m的最低抑菌浓度值(MIC)。
       2.1.1  抗真菌药物储备液、稀释液的制备称取DJC粉末204.8 mg，用1 ml 二甲基亚砜(DMSO)溶解，制成浓度为204 800 μg·ml-1的储备液，存于-20 ℃冰箱备用；称取TBF 8 mg，用1 ml DMSO溶解，制成浓度为8 000 μg·ml-1的储备液。从中吸取1 μl加RPMI-1640培养基499 μl，使之稀释500倍，此时TBF储存液浓度为16 μg·ml-1，存于-20 ℃冰箱备用。
       
       将DJC储备液、TBF储备液分别用RPMI-1640培养基倍比稀释成2倍终浓度。DJC的2倍终浓度由高向低依次为：2048，1024 ，512，256，128 ，64，32，16，8，4 μg·ml-1；TBF的2倍终浓度由高向低依次为：0.16，0.08，0.04，0.02，0.01，0.005，0.002 5，0.001 25，0.000 625，0.000 312 5 μg·ml-1。
       2.1.2  菌接种液的制备
       
       皮肤癣菌：将受试的皮肤癣菌接种于马铃薯培养基(PDA)上，26℃培养7～14 d。吸取2 ml无菌的0.85%的NaCl溶液，冲洗菌落表面的菌丝和孢子，将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数，将其浓度调至l×105～5×105 cfu.ml-1之间，用RPMI-1640培养基稀释50倍至2倍终浓度。
       
       念珠菌：将受试的念珠菌接种于马铃薯培养基(PDA)上，36 ℃培养48 h。挑取菌落，加入2 ml无菌的0.85%的NaCl溶液中，用0.5# McFarland standard 比浊管比浊，用RPMI-1640液基稀释100倍后再稀释20倍至2倍终浓度。
       2.1.3  接种将100 μl的2倍终浓度的药液，由第1孔至第10孔分别由高浓度到低浓度加入无菌96孔细胞培养板中，第11孔为生长对照孔（仅加菌悬液100 μl和RPMI-1640培养基100 μl，不加药物），第12孔为空白对照孔（真菌、药物都不加，只加RPMI-1640培养基200 μl）。将调好的菌接种液100 μl，分别加入相应的微孔内，这将使每一梯度的抗真菌药物和菌接种液（2倍终浓度）分别被1∶1稀释到终浓度。
       2.1.4  结果的判定皮肤癣菌，26 ℃孵育7～14 d读结果；念珠菌，36 ℃孵育48 h读结果。读取MIC值时，应在不搅动的情况下与对照孔按下列标准比较：肉眼清晰为0；略模糊(80%受抑制)为1；浊度显著减低(50%受抑制)为2；浊度轻度减低为3；浊度未减低为4。本实验药物取1（略模糊）或2（浊度显著减低）为判定终点。
       2.1.5  质量控制按照NCCLS方案，对近平滑念珠菌XYZ 5001进行反复测定，其两性霉素B的MIC值0.5～4.0 μg·ml-1，氟康唑的MIC值1.0～4.0 μg·ml-1，5-氟胞嘧啶的MIC值0.12～0.5 μg·ml-1。每次试验以此菌株为对照，只有当其MIC值介于其质控范围之内时，方认为实验操作准确可靠。且只有当生长对照孔生长良好，空白对照无生长，其它孔随药物浓度升高，呈现真菌生长梯度受抑制时，方证明试验成功。
       2.2  最小杀真菌浓度（MFC)的测定按文献方法［4］取药敏实验中肉眼判断无菌生长的培养液（同时取对照孔）接种于PDA上，继续培养。皮肤癣菌观察14 d，14 d后观察其是否有真菌生长。MFC即为无菌生长所对应的最低药物浓度。
       3  结果
       3.1   DJC和TBF对T.r ，T.m 的MIC值测定结果见表1。
       表1   DJC和TBF对60株皮肤癣菌的抗真菌MIC值（略）
       3.2  杀菌实验结果 见表2。从DJC对T.r，T.m杀菌活性的结果可见，两种6株皮肤癣菌均生长；TBF作用后，两种6株皮肤癣菌均未生长。
       表2  DJC和TBF对6株皮肤癣菌的杀菌结果（略）
       4  讨论
          
       丝状真菌（皮肤癣菌）体外药敏实验方案，由于丝状真菌本身的诸多特点如产孢条件难以控制、接种量难以精确量化、孵育时间长等，使其实验方法标准化具有一定难度。迄今为止，国内外尚无统一的丝状真菌药敏试验的标准化方法。NCCLS于1998年推出了《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》，即M38-P方案，该方案准确性好、重复性高，在终点判定、结果的解释方面均有详细的规定，实验室间结果的一致性可以与抗细菌的药物敏感试验相媲美［5］。在此基础上，NCCLS在某些抗真菌药物的最低抑菌浓度，即MIC值的判定等方面进行了广泛深入的多中心研究，加上新型三唑类药物的问世和临床应用的逐渐增多，于2002年推出了新版产孢丝状真菌抗真菌药物敏感性试验方案，即M38-A，该方案是一个测定丝状真菌对不同抗真菌药物敏感性的标准化程序，制定该方案的目的是希望经过相同的标准化程序，使不同实验室获得的药物敏感性结果具有可比性或者可重复性［2］。
       
       本研究采用NCCLS推荐的M38-A方案，并以特比萘酚（TBF）为阳性对照药，研究了地锦草提取物对60株皮肤癣菌的体外抑真菌活性。结果，地锦草提取物对两种皮肤癣菌的MIC值范围均为128～1024 μg·ml-1，对T.r，T.m的平均MIC分别为446，539 μg·ml-1。阳性对照药Terbinafine对60株皮肤癣菌的MIC范围均在0. 0025～0. 005 μg·ml-1之间，与文献报道一致［6］。从地锦草提取物对皮肤癣菌的杀菌活性结果，可见两种6株皮肤癣菌均生长，提示地锦草对皮肤癣菌的体外抗真菌活性，主要是通过抑制真菌的生长而起作用。TBF为新型丙烯胺类抗真菌药，是一种杀真菌药［7］，从TBF对皮肤癣菌杀菌活性结果，证实TBF是一种杀真菌药。
       
       地锦草是维吾尔医常用药材，临床主要用其复方百癣夏塔热（由地锦草、诃子肉、毛诃子肉、司卡摩尼亚酯、芦荟、西青果等药材组成），治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病等皮肤疾病［3］。邓淑文等［4］、古力娜·达吾提等［8］均采用M38-P方案，分别测定了百癣夏塔热对171株、雅丽蔓（地锦草）总黄酮对30株临床常见皮肤癣菌的MIC值。结果证明体外抗真菌活性，地锦草总黄酮＞地锦草提取物＞百癣夏塔热。我们推测地锦草体外抗真菌的活性成分可能是黄酮类。文献报道地锦草的化学成分主要为黄酮、鞣质类化合物［9］。现代药理学研究表明，地锦草有抑制和杀灭细菌的作用，并且其抑菌和杀菌的活性与其提取物中的总黄酮含量呈正相关［10］。但是，还未见地锦草总黄酮和其抗真菌作用相关性的深入报道。因此，进一步研究地锦草总黄酮抗真菌作用的机制，以及从地锦草中寻找新型抗真菌化合物，是今后研究的方向。
       
       致谢：新疆医科大学药学院刘发教授，新疆医科大学第一附属医院真菌与真菌病研究中心邓淑文博士。
       【参考文献】
         ［1］ 买买提明·沙比尔,乌兰,阿尔甫,等.维吾尔药材标准上册,第1版［S］.乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1993:99.
       
       ［2］ National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Approved Standard (M38-A) ［P］. USA, 2002-08.
       
       ［3］ 亚森·吐尔逊,哈木拉提,张彦福,等.中华人民共和国卫生部药品标准-维吾尔药分册,第1版［S］.乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社，1999:124.
       
       ［4］ 邓淑文,哈木拉提.百癣夏塔热体外抗真菌活性研究［J］.中药药理与临床,2006，22(3，4):166.
       
       ［5］ Espinel-ingroff A, Bartlett M, Bowden R, et al. Multicenter Evaluation of Proposed Standardized Procedure for Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi［J］. Clinical Microbiology, 1997，35(1): 139.
       
       ［6］ 古力娜·达吾提,尤丽吐孜,艾则孜·亚森,等.维药地锦草软膏的体外抗真菌及其对豚鼠皮肤真菌感染的治疗作用研究［J］.中药药理与临床,2007，23(5):178.
       
       ［7］ Schmitt HJ, Bernard EM, Andrade J, et al. MIC and Fungicidal Activity of Terbinafine against Clinical Isolates of Aspergillus spp［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1988，32(5): 780.
       
       ［8］ 古力娜·达吾提,努尔买买提·艾买提,尤丽都孜·买买提,等.雅丽蔓(地锦草)总黄酮体外抗真菌作用研究［J］.中国民族医药杂志,2006，4: 44.
       
       ［9］ Yoshiaki A, Keita K, Tsutoma H, et al. Four new Hydrocyzable Tannins and an Acylated Flavonol Glycoside from Euphorbia maculate ［J］. Canadian Journal of Chemistry, 1997，75 (6):727.
       
       ［10］ 邵 留,沈盎绿,郑署明.斑地锦总黄酮的提取及抑菌作用［J］.西南农业大学学报(自然科学版),2005，27(6):902.
       
       