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       【摘要】 
       目的建立高效液相色谱（HPLC）法测定丹参提取物中水溶性成分丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B含量的方法。方法高效液相色谱梯度洗脱法。色谱柱为Hypersil ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为1%冰醋酸溶液（A）和甲醇（B）梯度洗脱；检测波长为281 nm；流速为1.0 ml·min-1；柱温25℃。结果丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B线性范围分别在0.26～2.08 μg，0.13～1.04 μg，0.45～3.60 μg内线性关系良好(r ≥0.999 6)；加样回收率分别为97.76 %，99.56%，99.68 %，RSD＜3.4%。结论该方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可用于丹参提取物质量控制。
       【关键词】  丹参提取物； 水溶性成分； 高效液相色谱
       Determination of 3 Water-soluble Components in the Extract from Salvia miltiorrhiza Bge. by HPLC
       DIAN Linghui, CUI Liao,WU Tie 
       （Guangdong Medical College, Dongguan 523808,China）
       Abstract：ObjectiveTo develop an HPLC method for determination of 3 water-soluble components-danshensu, protocatechuic aldehyde and salvianolic acid B in the extract from Salvia miltiorrhiza Bge.Methods The analysis was carried on with a column of Hypersil ODS C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm) by HPLC at 25℃，with gradient elution of 1%(v/v) acetic acid (A)-methanol (B) as the mobile phase. The flow rate was 1.0 ml·min-1 and the detection wavelength was 281 nm. ResultsThe linear ranges of danshensu, protocatechuic aldehyde and salvianolic acid B were 0.26～2.08 μg, 0.13～1.04 μg and 0.45～3.60 μg respectively, and all the compounds showed good linearity(r≥0.999 6) in corresponding detected concentration range. The average recoveries were 97.76%, 99.56%, 99.68 %, and RSD was less than 3.4%. ConclusionThe method is simple, sensitive, accurate, reproducible, and can be used to control the quality of extract from Salvia miltiorrhiza Bge..
       Key words： Extract from Salvia miltiorrhiza Bge.;  Water-soluble components;  HPLC
       
       传统中药丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根及根茎，是著名抗衰老中药。近代已从中分离得到多种化学成分，含有酚酸类水溶性成分和二萜类脂溶性成分两大类，水溶性成分有原儿茶醛、丹参素、丹酚酸B等。丹参的水溶性成分不仅具有显著的抗氧化、抗自由基、抑制低密度脂蛋白氧化的特性，而且具有护肝、抗肝癌、抗心血管疾病以及抑制HIV病毒对宿主细胞的感染等作用［1］。最近研究发现丹参水提物和丹参素促进成骨细胞活性和防治泼尼松所致大鼠骨质疏松［2］。丹参提取物主要成分为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B等，笔者参考有关文献［3］采用HPLC法测定丹参提取物中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B的含量，该方法操作简便、灵敏度高、重现性好，为丹参中药制剂质量标准的研究提供实验依据。
       1  仪器与试药
          
       Angilent1100高效液相色谱仪，SPD二极管阵列检测器，自动进样器（美国Agilent公司），柱温箱和ChemStation工作站。对照品：丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B (中国药品生物制品检定所，批号分别为：110855、0810和111562)；丹参提取物（由广东医学院科技开发中心提供）；甲醇（色谱纯）；三次重蒸馏水；冰醋酸（分析纯）；0.45μm微孔滤膜。
       2  方法与结果
          
       色谱条件：采用Hypersil ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特）；流速：1 ml·min-1；检测波长：281 nm；柱温：25 ℃；进样量：20μl；流动相为1%冰醋酸溶液（A）和甲醇（B）梯度洗脱（0～5 min,10% B;10～0 min, 35% B;31～46 min，10%B）。在选定条件下，丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B和样品中其他组分色谱峰可达基线分离，且与其他相邻色谱峰分离度大于1.2，按丹参素钠峰计算，理论板数在3 000以上。其色谱图见图1。
       2.1   供试品溶液的制备 精密称取丹参提取物0.2 g，置于100 ml三角瓶中，加入蒸馏水30 ml，超声溶解10 min，过滤，加水定容至50 ml，经0.45μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
       2.2  对照品溶液的制备精密称取丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B对照品适量，加1 %醋酸溶液溶解，丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的浓度分别0.104，0.052，0.180 mg·ml-1，即得混合对照品溶液。
       2.3  线性关系考察按上述色谱条件自动进样器吸取对照品溶液2.5，5，10，15，20 μl，记录色谱图。以对照品溶液进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，测定成分在线性范围内线性关系良好。见表1。
       2.4  方法学考察
       2.4.1  精密度实验精密吸取对照品溶液20 μl，连续进样5次，记录丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的峰面积，计算RSD，分别为1.82%，1.25%和2.13 %，说明仪器精密度良好。
       表1  线性结果（略）
       2.4.2  稳定性实验精密吸取供试品溶液，每隔一定的时间测定1次，记录丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的峰面积，供试液在12 h内测得的峰面积基本一致，说明供试液在12 h内基本稳定。
       2.4.3  重复性实验精密称取丹参提取物5份，按“2.1项”方法制得供试液，按上述色谱条件测定丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的含量，其RSD分别为2.01%，1.81%和1.68%，说明重复性良好。
       2.4.4  回收率实验精密称取已知含量的丹参提取物0.2 g 5份，置100 ml三角瓶中，分别加入对照品溶液5 ml，按“2.1项”方法制得供试液，按上述色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表2。 
       图1  HPLC图（略）
       2.4.5  样品含量测定精密吸取对照品溶液和供试溶液各20 μl，按前述色谱条件进样分析，测得各成分的峰面积，采用外标法计算供试品中丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的含量。其含量分别为24.42，1.77，32.10 mg·g-1（n=3）。
       表2  加样回收率实验结果（略）
       3  讨论
          
       丹参水溶性成分主要是酚酸类化合物，在中性流动相中易发生离解，使含量偏低且拖尾严重，故本实验采用了在流动相中加入少量醋酸，抑制其离解并改善峰形和分离度。本实验考察了不同的梯度洗脱系统，结果表明采用上述流动相体系，3个组分分离度满足要求且峰形好。
       
       中药是多种化学成分共同作用而发挥药效，单一成分含量的高低不能全面反映中药的药效。本文根据丹参粉的药理实验确定以水溶性成分——丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B为含量测定指标，以多指标多成分的含量测定体系来综合评价药材及其制剂的质量，体现中医药整体作用的特点。该实验方法操作简便、准确、专属性强，可用于丹参提取物的质量控制。
       【参考文献】
         ［1］ 许继文,付春梅.丹参的药理作用研究进展［J］. 医学综述，2006,12(23):1467.
       
       ［2］ 崔 燎,邹丽宜,刘钰瑜,等．丹参水提物和丹参素促进成骨细胞活性和防治泼尼松所致大鼠骨质疏松［J］. 中国药理学通报，2004,20(3):286.
       
       ［3］ 张文生,李德坤,叶正良.反相高效液相色谱法测定丹参提取物中丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的含量［J］. 药物分析杂志，2003,23(6):475.