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       【摘要】 
       目的观察高血压病血淤证患者血清对人脐静脉内皮细胞株（ECV-304）分泌NO，ET的影响及丹参酮ⅡA（TanⅡA）的干预作用。方法硝酸还原酶法检测细胞分泌的一氧化氮（NO）浓度，非平衡法测定细胞分泌的内皮素（ET）；观察不同浓度丹参酮ⅡA对细胞分泌NO，ET的干预作用。结果血淤组分泌的NO低于对照组、健康组，且差异显著（P<0.05或P<0.01）；血淤组分泌的ET高于对照组、健康组、非血淤组，且差异显著（P<0.05或P<0.01）；TanⅡA 40，20 μg/ml剂量组分泌的NO较血淤组低，10，5 μg/ml剂量组分泌的NO较血淤组高，但均无显著差异；TanⅡA40，20，15，5 μg/ml剂量组分泌的ET较血淤组低，其中40，20 μg/ml剂量组无显著差异，10，5 μg/ml剂量组有显著差异（P<0.01）。结论血淤证患者血清可损伤培养的内皮细胞，引起其内分泌功能发生改变，TanⅡA具有保护内皮细胞的功能。
       【关键词】  高血压病； ECV-304； 血淤证
       血淤证见于多种疾病，是一种综合性病理状态，形成机理非常复杂。其形成与血液流变学异常、血流动力学异常、微循环障碍、血液凝固性、炎症病理过程、动脉粥样硬化、红细胞膜流动性及血管内皮细胞损伤等有关，其中热点是对血管内皮细胞损伤的研究。血管内皮细胞损伤与血淤证发生、发展密切相关，因此通过观察血淤证患者血清对人脐静脉内皮细胞株（ECV-304）活性的影响，可深入研究血淤证形成的病理机制。本实验研究了高血压病血淤证患者血清对ECV-304分泌NO，ET的影响及丹参酮ⅡA（TanⅡA）的干预作用。
       1  材料与仪器
       1.1  细胞来源人脐静脉内皮细胞株（ECV-304）由武汉大学“中国典型培养物保藏中心”提供。
       1.2  血清的收集
       1.2.1  研究对象的选择高血压病血淤证组：40例，为2005-05～2006-05暨南大学附属第一医院心血管科、中医科门诊及住院确诊患者。诊断符合世界卫生组织/国际高血压病学会统一的“高血压病”诊断标准，血淤证诊断参照1986年修订的诊断标准。其中，按血压级别分为：2级高血压患者32例，3级高血压患者8例；男性患者22例，女性患者18例；平均收缩压（161.63±17.74）mmHg，平均舒张压（91.13±15.21）mmHg；平均年龄（75.70±7.06）岁。本课题选用的血淤证病例主要为气虚血淤证、阴虚血淤证、痰湿血淤证，少量为热结血淤证和气滞血淤证。所选病例能较好的代表血淤证的各种兼证的临床分布情况。
       
       高血压病非血淤证组：40例，为同期暨南大学附属第一医院心血管科、中医科门诊及住院确诊患者。诊断符合世界卫生组织/国际高血压学会统一的“高血压病”诊断标准，其中，按血压级别分为：2级高血压患者31例，3级高血压患者9例；男性患者20例，女性患者20例；平均收缩压（156.43±16.01）mmHg，平均舒张压（87.53±9.69）mmHg；平均年龄（76.53±8.95）岁。
        
       两组患者均为原发性高血压病患者，排除有靶器官损害或糖尿病，排除心、脑、肾等并发症，检查前1周未服用影响血压的药物。两组患者的血压分级、性别分布、平均血压、平均年龄无统计学差异（P>0.05），具有可比性。
       
       健康组：选择暨南大学医学院中医系一年级本科生健康志愿者30人作为正常对照组。健康人血压均在正常范围，与高血压病患者（包括血淤证和非血淤证患者）血压比较，有统计学差异(P<0.01)。
       1.2.2  血清收集患者组及对照组均空腹取血，置入无菌带帽不抗凝干燥试管，自凝后离心（4℃，2 000 r/min，15 min），取上清液置无菌EP管，冻存于-20℃，备用。
       1.3  药物及试剂配制TanⅡA系中国药品生物制品检定所生产，批号：110766-200417，取TanⅡA 2 mg，溶于50 μl的DMSO，制成母液，浓度为40 μg/μl，4℃避光保存。
       
       一氧化氮试剂盒购自南京建成生物工程研究所，内皮素放免药盒购自解放军总医院科技开发中心放免所，DMEM培养基为Gibco公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；青霉素、链霉素为华北制药股份有限公司产品；其他试剂如碳酸氢钠、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖，均为国产分析纯。
       1.4  仪器721分光光度仪为上海第三分析仪器厂产品；FJ-2008G型γ计数器为西安二六二厂产品；超速离心机为日本HITACHI公司产品。
       2  方法
       2.1  分组
       2.1.1  血淤组与非血淤组、健康组及对照组比较①血淤组: 10％血淤证患者血清＋90％DMEM；②非血淤组：10％非血淤证患者血清＋90％DMEM；③健康组：10％健康人血清＋90％DMEM④对照组：100％DMEM。
       
       2.1.2  药物分组（每组以10ml计算）①血淤组：8 990μl DMEM＋1 000 μl血淤证患者血清＋10 μl DMSO；②TanⅡA 40μg/ml组：8 990 μl DMEM＋1 000 μl血淤证患者血清＋10 μl TanⅡA母液；③TanⅡA 20 μg/ml组：8 990 μl DMEM＋1 000 μl血淤证患者血清＋5 μl TanⅡA母液＋5μl DMSO；④TanⅡA 10 μg/ml组：8 990 μl DMEM＋1 000 μl血淤证患者血清＋2.5 μl TanⅡA母液＋7.5 μl DMSO；⑤TanⅡA 5 μg/ml组：8 990μl DMEM＋1 000 μl血淤证患者血清＋1.25 μl TanⅡA母液＋8.75 μl DMSO。
       
       本实验DMSO的终浓度为0.1％（DMSO的终浓度不超过0.1％时，对细胞生物性状无影响），各组培养基经过滤除菌后备用。
       2.2  细胞接种及样本收集按1×105/ml，接种于24孔培养板，1 ml/孔。用含10％FBS的完全培养基培养24 h后，换无血清培养液再培养24 h，按以上实验分组方案分组，继续培养24 h，每组9个复孔，再以PBS液洗涤3次 ，换无血清培养液再培养24 h后，取细胞培养上清液，置于无菌EP管，冻存于-20℃冰箱。
       2.3  观察项目及检测方法
       2.3.1  NO检测硝酸还原酶法。
       
       计算公式：NO含量（μmol/L）＝（测定管吸光度－空白管吸光度）÷（标准管吸光度－空白管吸光度）×标准品浓度（100μmol/L）×样品测试前稀释倍数
       2.3.2  ET测定采用非平衡法。结果计算：由自动γ计数器预先编制程序，直接给出有关参数、标准曲线及样品浓度见表1～2。
       2.4  统计学方法计量数据以±s表示,组间比较用单因素方差分析。
       3  结果
         
       见表1，表2。表1提示，血淤证患者血清可损伤内皮细胞，使NO生成明显减少，ET明显增多。表2提示，TanⅡA能增加内皮细胞NO分泌，减少内皮细胞ET分泌。
       表1  各组细胞释放的NO，ET比较（略）
       与血淤组比较，★P<0.01，△P<0.05；n=9
       表2  TanⅡA对细胞释放NO，ET的影响（略）
       与血淤组比较，★P<0.01；n=9
       4  讨论
          
       现代医学认为，血管内皮细胞的损伤及血管收缩、舒张调节的异常是引发高血压病的重要因素。NO和ET是内皮细胞释放的两种主要血管活性物质。NO具有刺激血管平滑肌舒张，抑制血小板聚集以及抑制内皮细胞增殖等作用；而 ET是迄今发现的最强的收缩血管物质，它通过刺激血管平滑肌细胞增殖，参与并促进高血压病的发生和发展，除了直接收缩血管外，还能促进其他收缩血管物质产生，如血管加压素、儿茶酚胺、肾上腺皮质激素等。在高血压病病理状态下，血管内皮细胞合成和释放NO明显减少，内皮素、前列腺素H2等收缩因子的增加，拮抗了NO的作用，使血管舒缩功能失调引起血压升高。因此，内皮细胞功能的完整在一定程度上依赖NO和ET等血管活性物质的动态平衡。
       
       黄俊等［1］发现老年EH患者血浆sICAM-1和ET水平明显高于正常对照组，经培哚普利治疗8周后其浓度明显下降；而其血浆NO水平显著低于对照组，经培哚普利治疗后浓度上升。认为老年EH病人血浆sICAM-1和ET水平较正常老年人明显升高而NO水平明显降低。培哚普利在降血压的同时能降低老年EH患者血sICAM-1和ET浓度并升高NO浓度，减少高血压并发症发生。徐树楠等［2］发现活血降压方能明显降低自发性高血压大鼠的血压，升高血清中NO，降低血浆中ET。认为活血降压方通过不同途径改善自发性高血压大鼠的病理变化而达到降血压作用的效果。本实验结果表明，高血压病患者血清作用于血管内皮细胞后，与健康人比较，内皮细胞分泌的NO减少，而分泌的ET增多，与以往的体内实验结果一致。
         
       本实验结果提示，血淤证患者血清可损伤培养的内皮细胞，引起其内分泌功能发生改变，与健康组比较，NO生成明显减少，ET明显增多，这与文献报道一致。华军益等［3］发现高浓度葡萄糖和低密度脂蛋白对血管内皮细胞具有协同损伤作用， 而NO含量则随作用时间延长表现出先升高后下降的动态变化过程。认为可能与高糖造成氧化应激，生成大量的活性氧(ROS)、促进脂质过氧化以及损伤内皮NO系统有关。赵亮等［4］发现抵抗素呈剂量依赖性促进HUVECs分泌ET-1，抗抵抗素IgG能够完全抑制高浓度抵抗素引起的ET-1分泌。生理剂量的脂联素对高浓度抵抗素引起的ET-1的分泌无明显抑制作用。认为抵抗素导致血管内皮细胞功能紊乱，促发糖尿病血管病变，而脂联素在糖尿病血管病变中起保护作用。
       
       本实验结果显示，TanⅡA能增加内皮细胞NO分泌，减少内皮细胞ET分泌，具有保护内皮细胞的功能。这与以往的体内实验报道一致。孙学刚等［5］发现定心方和丹参酮均能增加心脏血中NO含量,减少心律失常的发生。认为定心方和丹参酮能通过增加血中NO含量而防治心律失常。张艳军等［6］发现丹酚酸B能够减少动脉粥样硬化家兔血浆TXB2、ET浓度，增加6-keto-PGF1α浓度，丹参酮ⅡA对动脉粥样硬化家兔血浆TXB2、6-keto-PGF1α、ET没有明显影响，认为丹参水溶性成分与脂溶性成分在治疗动脉粥样硬化过程中作用靶点及机制不同。
       【参考文献】
         ［1］ 黄 俊，刘昌慧，张黎军.老年高血压病患者血浆sICAM-1及ET和NO水平变化与培哚普利对其影响［J］.中国医师杂志，2004，6（4）：486.
       
       ［2］ 徐树楠，张再康，冯瑞雪，等.活血降压方对自发性高血压大鼠血压及血浆ET、血清NO含量的影响［J］.中药药理与临床，2004，20(5)：39.
       
       ［3］ 华军益，胥 昀，何煜舟.高浓度葡萄糖和低密度脂蛋白对血管内皮细胞的协同损伤及NO释放的影响［J］.浙江临床医学，2005，7（11）：1126.
       
       ［4］ 赵 亮，李茵茵，张红霞.抵抗素对原代培养的脐静脉内皮细胞分泌ET-1、TGF-β1的影响［J］.山东医药，2006，46（7）：1.
       
       ［5］ 孙学刚,贾钰华,陈育尧.定心方及丹参酮防治大鼠缺血再灌注性心律失常的NO机制研究［J］.山东中医杂志，2000，19（6）：358.
       
       ［6］ 张艳军，张发艳，范英昌.丹酚酸B、丹参酮ⅡA对家兔动脉粥样硬化模型内皮细胞功能的影响［J］.天津中医药，2005，22（4）：328.