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       【摘要】 
       目的研究花椒挥发油体内外抗小鼠H22肝癌细胞作用及其免疫学机制。方法花椒挥发油按不同时间（24，48，72 h）及不同浓度（0. 5～8 mg/ml）分别处理H22细胞，MTS法分析细胞的增殖速度，用流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期。建立H22荷瘤小鼠模型，观察小鼠肿瘤的生长情况,计算肿瘤生长抑制率；ELISA法检测花椒挥发油处理后小鼠血清中IL-2和IL-12的活性。结果4 mg/ml花椒挥发油处理H22细胞72 h可显著地抑制H22细胞增殖，1 mg/ml花椒挥发油处理H22细胞72 h即可导致亚凋亡峰的出现，且G0/G1期细胞增多, S期和G2/M期细胞减少，花椒挥发油对小鼠实体瘤生长具有显著抑制作用，但不能提高荷瘤小鼠血清中IL-2和IL-12的水平。结论花椒挥发油可抑制H22细胞增殖并激发细胞凋亡，但不能通过提高机体的免疫功能发挥抗肿瘤作用。
       【关键词】  花椒； H22细胞； 凋亡； 免疫功能
       Primary Study of the Anti-tumor Effect and its Mechanism of Zanthoxylum in vivo and in vitro
       YUAN Taining,WANG Yanlin, WANG Junzhi
       (School of Medicine,Three Gorges University, Yichang, Hubei, 443003, China； School of Chemistry and Biology, Three Gorges University, Yichang, Hubei, 443003, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the anti-tumer effect and its immunological  mechanism of the essential oil of zanthoxylum in vivo and in vitro. Methods Treating H22 cells at different time and with different concentration of the essential oil of zanthoxylum, MTS was used to assay the cell proliferation, flow cytometry was used to assay the cell apoptosis and cell cycles. The H22 BALB/C xenograft tumor modes were established. The anti-tumor effect of zanthoxylum was observed and tumor growth inhibitory rate (IR) was calculated. The content of serum IL-2 and IL-12 were examined by ELISA assay. ResultsTreating H22 cells 72h by 4mg/ml essential oil of zanthoxylum resulted in remarkable inhibition of the cell proliferation.Treating H22 cells 72h by 1mg/ml essential oil of zanthoxylum resulted in appearance of sub-G1 and increase G0/G1 phase cells and decrease S phase and G2/M phase cells. The essential oil of zanthoxylum inhibited the growth of tumor in tumor-bearing mice. However, essential oil of zanthoxylum could not increase the contents of murine serum IL-2 and IL-12.  ConclusionThe essential oil of zanthoxylum inhibits proliferation and induces cell apoptosis of H22 cells, but it can not exert the anti-tumor efficiency through reinforcing the immune function.  
       Key words： Zanthoxylum ;   H22 cells;   Apoptosis;   Immune function
        
       花椒属一种温热类中草药，辛,热,有小毒，归脾、肾两经,功能温中止痛,解毒杀虫，常用于治疗脾胃虚寒症。花椒还是深受民众喜爱的重要食用性香料，其资源在我国分布很广,安全性高。国内外研究报道花椒对消炎、镇痛、杀菌、抗病毒、抗寄生虫、抗真菌、抗氧化等均具有较强的作用［1～5］。随着对花椒提纯和药理作用的深入研究,发现花椒还具有抗肿瘤作用,但目前对花椒抗肿瘤的研究还不够深入,其体内的抗肿瘤作用研究则更少。为了认识花椒在体内外抗肿瘤作用的机制和特点,我们选用小鼠H22肝癌细胞为研究对象,观察了花椒在体内外对该细胞的作用，以期探讨花椒在体内外抗肿瘤作用及其可能的机制。
       1  材料
            
       成熟花椒,采于湖北宜都，经汪鋆植博士鉴定为Zanthoxylum bungeanum。H22腹水型小鼠肝癌细胞由本院保存，清洁级BALB/C小鼠由同济医科大学动物中心提供。MTS细胞增殖分析试剂由Promega公司提供。EPL CSXL流式细胞分析仪为Becman Coulter公司产品,全波长酶标仪为为Thermo公司产品，R206D旋转蒸发器为上海申生科技有限公司产品。
       2  方法
       2.1  花椒挥发油制备使用旋转蒸发器提取花椒果皮挥发油并过滤除菌，称取适量挥发油加入5%Tween-80溶解的水溶液中，超声破碎仪处理10 min，用RMPI1640无血清培养基或生理盐水稀释成所需要的浓度。
       2.2  细胞增殖分析　将对数生长期的H22细胞以4×107/L细胞数接种于圆底96孔培养板,每孔50 μl。37 ℃培养24 h后,向孔内直接加入含不同浓度（8，4，2，1，0.5mg/ml）花椒挥发油的RPMI1640培养基50 μl。在加入药物后选定的时间点(24，48，72 h),向每孔中加入20 μl MTS试剂,37 ℃继续保温2 h显色,于490 nm波长下读取OD值。
       
       细胞生存率（％）=OD药物/OD对照×100％；
       
       细胞生长抑制率（％）=(1-细胞生存率)×100%
       2.3   流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期取1×106对照细胞或经不同浓度（8，4，2，1，0.5 mg/ml）花椒挥发油处理的细胞,用冰冷PBS洗涤1次后,再悬浮于500 μl低渗DNA染色液中(1 g/L Sodium Citrate, 0.1%TritonX 100, 100 mg/L RNase, 50 mg/L Propidium Iodode), 4 ℃保温30 min后,经流式细胞仪分析凋亡细胞及细胞周期时相分布，计算细胞增殖指数（PI）。
       
       PI=（S+G2/M）÷(G1+S+G2/M)×100%
       2.4  花椒挥发油对H22荷瘤小鼠移植瘤生长的影响取对数生长期H22细胞, 以RPMI1640调整细胞浓度为5×106/ml,于BALB/c小鼠左侧下腹部行无菌皮下接种0.2 ml细胞悬液。接种24 h后将BALB/c小鼠随机分为5组,给药剂量分别为10，25，50 mg/kg体重和100 mg/kg体重，阴性对照组给予等量无菌生理盐水(NS)，每组小鼠10只，隔日腹腔注射给药0.2 ml/只，连续给药7次。停药后次日处死小鼠，剥出瘤体称重并测量体积，计算肿瘤生长抑制率（IR）。
       
       肿瘤生长抑制率（IR，％）=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%
       2.5  花椒挥发油对荷瘤小鼠血清中IL-2和IL-12水平的影响各组小鼠停药后次日采用眼球摘除法取血，静置后离心分离血清，ELISA法检测花椒挥发油处理后荷瘤小鼠血清中IL-2和IL-12的活性。
       2.6  统计学处理数据用±s表示, 采用组间t检验进行统计分析。
       3  结果
       3.1  花椒挥发油抑制H22细胞的增殖花椒挥发油对H22细胞增殖呈明显抑制作用，且这种抑制随药物浓度加大和药物作用时间延长而增加（图1）。花椒挥发油浓度为4 mg/ml时，24 h抑制率为19%, 48 h抑制率为45%, 72 h抑制率为76%。
       图1  花椒对H22细胞生长的影响（略）
       3.2  花椒挥发油诱导H22细胞的程序性凋亡因发生凋亡的细胞核内,部分DNA发生片段化降解而丢失,经Propidium Iodode染色后, 这部分细胞核将出现在G1峰之前,即亚凋亡峰的位置。1 mg/ml花椒挥发油处理H22细胞72 h即可导致亚凋亡峰的出现。所以花椒挥发油可诱导H22细胞的程序性凋亡。
       3.3  花椒挥发油抑制H22细胞周期的正常转换　1 mg/ml花椒挥发油作用72 h后G0/G1期细胞增多, S期和G2/M期细胞减少,作用具有明显的剂量依赖性（见图2）,显示花椒挥发油可有效抑制细胞周期的正常转换,使细胞在G1期堆积,细胞阻滞于G2 /M期,从而阻止细胞的有丝分裂,使细胞增殖受到抑制。
       图2  花椒对H22细胞周期的影响（略）
       3.4  花椒挥发油抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长10，25，50和100 mg/kg体重剂量花椒挥发油处理组小鼠的瘤体体积分别为(22.35 ±3.6)，(13.75 ±4.9)，(11.25±3.8) mm3和(10.16 ±3.2) mm3 ,明显小于阴性对照组小鼠瘤体体积(38.05 ±8.6) mm3, 成瘤时间也明显晚于阴性对照组; 10，25，50，100 mg/kg体重剂量花椒挥发油的抑瘤率分别为20.15% ，40.03%，60.25%和62.58%，明显高于阴性对照组( P<0.01) 。见图3。
       3.5  花椒挥发油不能促进H22荷瘤小鼠合成与分泌IL-2和IL-12   花椒挥发油处理后的H22荷瘤小鼠血清ELISA检测未见IL-2和IL-12水平明显变化（P>0.05）。
       图3  花椒对荷瘤小鼠肿瘤的生长的影响（略）
       4  讨论
          
       前人研究表明祖国传统中药可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤血管生成、逆转肿瘤细胞多药［6～10］课题组先后采用宫颈癌hela和Caski细胞进行了花椒体外抗肿瘤作用及其机制的研究。结果表明，花椒挥发油的确能在体外通过杀死肿瘤细胞或激发肿瘤细胞凋亡等方面发挥抗肿瘤作用。为了进一步了解花椒是否也能在体内发挥抗肿瘤作用，我们选用了小鼠H22肝癌细胞作为研究对象，研究发现花椒挥发油不仅在体外可有效抑制H22细胞周期的正常转换，阻止细胞的有丝分裂,抑制细胞生长并激发程序性细胞凋亡，而且在体内同样能显著抑制肿瘤生长。花椒挥发油体内抗肿瘤作用也随药物浓度加大和药物作用时间延长而增加。一般来说，增强机体免疫力可以在体内更好地发挥抗肿瘤作用，但本研究结果显示，花椒挥发油作用前后，小鼠血清中IL-2和IL-12的水平未发生明显改变，说明花椒挥发油对小鼠抗肿瘤细胞免疫应答反应没有明显促进作用，其体内抗肿瘤作用可能还存在其他的作用机制。    
       【参考文献】
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