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       【摘要】 
       目的通过观察帕金森病（PD）大鼠在不同时间点脑组织中伊文斯蓝(EB)含量变化来探讨急性和慢性PD大鼠血脑屏障（BBB）通透性的变化。方法脑立体定向将6羟基多巴胺（6OHDA）注入大鼠右侧纹状体建立PD模型。将大鼠随机分成对照组和模型组，后者又分为6 h，12 h，24 h，4周组，最后一组为慢性PD组。按BELAYEV法使用EB测定BBB通透性。结果急性PD大鼠BBB通透性在6 h达到高峰（P<0.01），12 h逐渐下降（P<0.05），持续至24 h（P<0.05），慢性PD大鼠（4周）与对照组相比无明显差异（P>0.05）。结论急性PD时伴有BBB的通透性增加，而慢性PD时BBB的通透性未见改变。
       【关键词】  帕金森病； 血脑屏障； 伊文斯蓝
       Study on the Alteration of  Blood-Brain Barrier Leakage in Rats with Acute and Chronic Parkinson Disease
       YAN Mingyu,CHEN Hong*,YANG Zanzhang, LIU Fei
       （Department of Pharmacology,College of Pharmacology, Shihezi University, Shihezi Xinjiang,832002 China; Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resources , Shihezi, Xinjiang,832002, China）
       Abstract：ObjectiveTo study the alteration of  blood-brain barrier (BBB) with parkinson disease（PD）measured by EB content in the brain tissue of rats with acute and chronic parkinson disease.MethodsThe parkinson disease model was established by direct injection of 6-OHDA into the right striatum area.The rats were randomly divided into control group and model group.The rats in model group were killed at hour 6, hour 12, hour 24 and week 4.The last group was chronic parkinson Disease rat model.The BBB permeability was assessed by Belyaev"s method.ResultsThe BBB permeability reached the peak at hour 6 （P<0.01）after 6-OHDA acute lesion,then decreased at hour 12（P<0.05）,lasted until 24 h（P<0.05）.The BBB permeability of chronic parkinson disease rats had no significant difference as compared with control group（P>0.05）. ConclusionThe permeability of BBB will increase in acute  parkinson disease rats but has no change in chronicity  parkinson disease rats.
       Key words： Parkinson Disease;   Blood-brain barrier;   Evens Blue
       
       帕金森病（Parkinson Disease, PD）是一种常见的中老年性疾病，主要病理学特征是中脑黑质部位多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性死亡［1］，引起纹状体内DA递质含量显著降低。6羟基多巴胺（6hydroxydopamine, 6OHDA）作为DA神经元的化学切断剂，注入脑内可引起DA神经细胞急性损伤致DA含量下降。短期应用可致急性PD模型，长期应用（4～5周）可制作慢性PD模型。我们将6OHDA注入鼠脑右侧纹状体分别建立急性和慢性PD模型，通过测量伤侧脑组织伊文斯蓝(Evens Blue，EB)含量来观察血脑屏障（bloodbrain barrier,BBB）通透性的改变，以探讨BBB的改变在急性和慢性PD发生中的作用。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器和试剂脑立体定位仪（美国BAS公司 SAS-4100型），牙科钻（韩国 Strong 90），Varioskan Flash 4.00.51型酶标仪（美国Thermo electron公司），HM202型十万分之一天平，HHS精密电热恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂)，高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；6OHDA(sigma 公司)，阿朴吗啡(sigma 公司)，甲酰胺（天津富宇精细化工有限公司），伊文斯蓝(上海新中化学厂生产)，Millipore超纯水系统。
       1.2   动物分组    健康雄性Wistar大鼠，体重220～250 g（新疆维吾尔自治区疾控中心提供）室温20～25℃,湿度50%～70%饲养，白天-黑夜分别12 h睡眠和活动，自由进食、饮水。随机分为对照组和模型组，后者按损伤后不同观察时相点又分为6 h，12 h，24 h，4周组。每组6只。
       2  方法
       2.1  动物模型制作实验鼠用2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（50 mg/kg），固定于脑立体定位仪上，齿杆较耳杆低约2.4 mm。头皮正中切口约6 cm，剥离骨膜，暴露前囟。定位方法依据Paxinos＆Watson所著《The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates》找到前囟。在右侧纹状体（靶点坐标为AP：+0.2 mm;ML：-3.0mm;DV：-3.5 mm）钻一直径为1 mm的小孔，用固定于立体定位仪上的微量注射器延针孔垂直进针。模型组：用10 μl微量注射器抽取6 μl 6OHDA（浓度3 μg/μl,含0.02%Vit C，现配现用）注入右侧纹状体内，注射速度0.5 μl/min，进药后留针15 min，退针5 min。缝合头皮，腹腔注射庆大霉素以预防感染。对照组：接受同样位点的注射，注射生理盐水6 μl（含0.02%Vit C），其他过程同模型组。术后放回笼中，单笼饲养，常规饲料，自由进食、饮水。
       2.2  行为学检测筛选慢性PD模型  第4组实验鼠（4周组）术后第2周开始经皮下注射新鲜配制的阿朴吗啡（APO）（按0.5 mg/kg给药），检测大鼠旋转行为。每周1次，直至术后4周。手动记数每分钟旋转次数及30 min内旋转总次数。恒定向损伤对侧旋转且旋转圈数超过7 r/min（30 min，210圈）的大鼠视为阳性，连续4周阳性者为合格的慢性PD动物模型。
       2.3  伊文斯蓝（EB）测定实验鼠在相应的时间点麻醉后，经股静脉注入2%EB生理盐水溶液（2 mg/kg）,几秒钟后大鼠眼球、结膜、四肢等均显示蓝色，表明注入成功。2 h后快速开胸暴露心脏，迅速穿刺左心室后剪右心耳一小孔，用37℃生理盐水灌注（灌注压为100 mmHg ）致右心耳流出无色清亮液体，以清除血液中的染料，断头取脑，取损伤侧半球。用甲酰胺消化法测脑组织中EB含量：取损伤侧脑半球组织标本，称湿重后置于盛有3 ml的甲酰胺试管中，60 ℃恒温水浴箱中孵育48 h，使脑组织中的EB充分溶解在甲酰胺溶液中。将溶有EB的甲酰胺溶液3 000 r/min离心15 min,取上清液，用酶标仪在EB最大吸收光谱630 nm处测其光密度值。BBB通透性用每克组织中含有EB的含量表示（μg/g)。
       
       伊文斯蓝标准曲线的制作：配置浓度为：4，1，0.6，0.4，0.2，0.1，0.05 μg/mlEB的甲酰胺溶液7管，置入60℃水浴箱中孵育48 h，用酶标仪在EB最大吸收光谱630 nm处测定各浓度EB溶液的光密度值,进行线性回归，求得回归方程为Y=53.546X-0.148 5 （X为光密度，Y为浓度）相关系数r=0.999 5（P<0.01）,其相关和回归效果均非常显著，绘出标准曲线。
       2.4  统计学处理 数据用±s表示。采用SPSS10.0软件，组间比较用t检验，多组比较用方差分析。α=0.05为检验标准。
       3  结果
       3.1  行为学观察第4组实验鼠（4周）在术后第2周开始，皮下注射阿朴吗啡后2 min左右，大鼠即开始向损伤对侧（本实验为左侧）旋转且速度>7 r/min，身体向左屈成环状，头尾衔接，以右侧后肢为支点，伴觅食样动作。并且出现尾僵直、竖毛，头、身体向左侧偏斜。
       3.2  EB定量检测结果如表1显示，与对照组相比，急性PD大鼠损侧半球的EB含量在6 h显著增加并且达到高峰(P<0.01)，之后逐渐降低，持续至24 h时仍显著高于对照组（P<0.05）。而4周后即慢性PD大鼠损侧半球的EB含量未见增加，与对照组比较无显著差异（P>0.05）。
       表1  损伤侧脑组织EB含量的变化（略）
       与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；n=7
       4  讨论
          
       PD大鼠模型分为急性损伤模型和慢性损伤模型［2］。急性损伤模型常用的方法是将6OHDA注射至黑质、纹状体或者内侧前脑束,使DA能神经元在数小时内快速的死亡。这种急性损伤模型一般都是伴随慢性损伤模型制作过程中出现,多应用于神经组织移植和基因治疗研究中［3］。慢性损伤模型制作方法与前者相同，DA能神经元的快速损伤后持续至数周并且伴有行为学的变化,被用来模拟PD的慢性病程［4］。
       
       BBB是由脑微血管内皮细胞、内皮细胞之间的紧密连接、基膜以及毛细血管周围的胶质细胞足突构成［5］，其中内皮细胞及紧密连接是BBB的重要形态学基础。BBB的特殊的结构使得98%的小分子化合物和几乎全部的大分子都不能透过大脑［6］，从而保持稳定的内环境。目前脑或CNS疾病已经成为严重威胁人类健康的一种疾病， PD病因不明、发病机制复杂，近几年的研究表明，加速老化、线粒体能量代谢障碍［7］ 、自由基的形成［8］、炎性介质和NO的释放在PD发病中起着重要作用，而诸如自由基、一些炎性介质和NO等血管活性物质的释放可能增加了BBB的通透性，打破了稳定的脑内环境。
       
       本实验采用分光光度计法检测渗入脑组织中EB含量，定量评价了急性和慢性PD时血脑屏障的损害程度。研究表明，6OHDA所致急性PD大鼠BBB的通透性在6 h增加并达到高峰，之后呈下降趋势，持续至24 h仍有明显的增加。而经过行为学筛选的慢性PD大鼠BBB的通透性未发生改变。结合以往研究分析，初步认为6-OHDA急性损伤时释放了一些致炎物质，由于致炎细胞因子的上调，促使中性粒细胞粘附到血管壁，导致脑微血管内皮细胞及基底膜损害，使BBB的通透性增加。其次过量自由基的释放可导致脂质、蛋白质及核酸过氧化，过氧化物损害了脑血管壁，破坏了BBB完整性。而慢性PD 模型历时较长，经过4周的时间曾经打开过的BBB又关闭，因此只能检测到极少量EB的渗入，但与对照组比较无统计学差异。
       
       综上所述，BBB损伤受多因素、多环节之间的相互作用，互为因果，形成恶性循环。因此保护BBB 的完整性可能是减轻6-OHDA急性损伤的重要措施。深入研究在急性PD时造成BBB损伤的各种机理，从不同的环节干预该病的病理过程，期望找到新的靶点并研发出有效的治疗药物，为PD的治疗开拓新的应用前景。
       【参考文献】
         ［1］ Kim J，Inoue K，Ishii J，et a1．A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neu-rons［J］.Science，2007，317(5842)：1220.
       
       ［2］ 牛朝诗，李 健.立体定向技术注射6-OHDA至内侧前脑束建立帕金森病大鼠模型［J］.立体定向和功能性神经外科杂志，2007，20（1）：19.
       
       ［3］ Carman LS,Gage FH,Shults CW.Partial lesion of the substantia nigra:relation between extent of lesion and rotational behavior［J］.Brain Res,1991,553(2):275.
       
       ［4］ 师长宏，周少波.帕金森病和L-DOPA诱导的运动障碍动物模型［J］.中国实验动物学杂志，2002，12（4）：254.
       
       ［5］ 李金辉，万海同.脑缺血血脑屏障损伤分子机制及中医药防治研究近况［J］.浙江中医药大学学报，2008，32（1）：127.
       
       ［6］ Pardridge WM.The Blood-Brain Barrier:Bottleneck in Brain Drug Development ［J］. Neurorx,2005,2(1):3-14.
       
       ［7］ 刘春杰，董立珉，刘 郁.中西医结合治疗帕金森病［J］.时珍国医国药，2006，17（3）：428.
       
       ［8］ Jenner P. Oxidative stress in Parkinson" disease［J］.Ann Neuro1,2003,53:S26.