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       【摘要】 
       目的对不同提取纯化工艺制备的金银花提取物注射液进行免疫毒性试验，以了解含金银花的注射剂致过敏反应的原因。方法按《中药、天然药物免疫毒性研究的技术指导原则》的要求，做金银花精提取物与粗提取物注射液的主动全身过敏试验。豚鼠腹腔注射致敏量以绿原酸计分别为7.5，1.5 mg·kg-1，静脉注射激发量是致敏量的2倍，激发后详细观察记录每只动物的反应情况。结果金银花精提取物注射液高、低剂量组动物均未出现过敏反应，而金银花粗提取物注射液高剂量组出现类过敏强阳性反应，低剂量组出现阳性反应。结论金银花粗提取物注射液出现类过敏反应的原因，与注射液中含有蛋白质、树脂、鞣质等杂质有关。
       【关键词】  金银花精提取物； 金银花粗提取物； 注射剂； 绿原酸； 过敏实验
       Experimental Study on the Active Systematic Anaphylaxis of Honeysuckle Refined Extract and Crude Extract Injection
       FENG Wenyu， LIU Minghua，XIAO Shunhan，HE Bing
       (Institute of Materia Medica，Luzhou, Sichuan 646000, China; Department of Pharmacology，Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China)
       Abstract:ObjectiveTo study the immune toxicity of Honeysuckle extract injection prepared by different extraction and purification processes，in order to analyze the causes of allergic reaction caused by Honeysuckle injection. MethodsAccording to the requirement of "Chinese traditional medicine，natural medicine immunity toxicity study ruller"，we studied active systematic anaphylaxis of Honeysuckle refined extract and crude extract injection.  Sensitizing dose(ip) counted as chlorogenic acid was 7.5，1.5 mg·kg-1, excitation dose(iv) was 2 times of sensitizing dose. The reaction of each animal was observed after excitation. ResultsThe result showed that no allergic reaction occurred in the high and low dose group of Honeysuckle refined extract injection，howerer strong positive reaction ouured in high dose Hoaeysuckle crude injection groups and positive reaction in low dose group.ConclusionThe causes of allergic reaction occurred in Honeysuckle crude extract injection are associated with impurity in the injection such as protein，resin，tannin.
       Key words:Honeysuckle refined extract；  Honeysuckle crude extract；  Injection；   Chlorogenic acid；  Allergic experiment
       
       金银花具有清热解毒、抗菌、抗病毒功效。以金银花为主研制的双黄连、清开灵等中药注射剂，被临床广泛用于上呼吸道感染、肺炎等高热疾病。由于疗效可靠，用量日增，不良反应也就更加突出。在人们寻找发生不良反应原因的时候，有人引用国外文献说金银花所含绿原酸与异绿原酸，既是抗菌抗病毒的主要有效成分，又是致敏原，认为中药注射剂变态反应严重与以绿原酸为代表的可疑致敏成分高度相关［1］；也有学者认为，中药注射剂发生不良反应的原因是多方面的，如超量使用、浓度过高、滴速过快等 ［2,3］。但更多的人认为，中药注射剂成分复杂，引起不良反应的主要原因是制剂质量问题，即目前有些产品质量控制与提取工艺不够完善，对非药用成分没能完全去除，致使有大量的杂质混在制剂中［4～7］。为此，我们将金银花精提取物与粗提取物注射液做对比过敏实验，观察供试品给予动物后的主动全身过敏反应情况，为中药注射剂中含有金银花的原药材筛选最佳的提取纯化工艺。
       1  材料
       1.1  供试品及其制备方法
       1.1.1  金银花粗提取物注射液批号070327，自制。制备方法：金银花2kg(产地：四川古蔺县，经鉴定为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand．-Mazz．的干燥花蕾)。加水2 000 ml,煎煮3次，1h/次。合并滤液，浓缩至2 000 ml，稍冷，加乙醇使含醇量达75﹪，静置24 h，滤过。醇滤液均分2份，留1份供制备金银花精提取物用，另1份加热挥醇后，加水至1 000 ml，放冷，调pH 6.5，冷藏24 h，滤过，高效液相测绿原酸含量，按每毫升含绿原酸3 mg投料，加注射用葡萄糖50 g，添水配成1 000 ml，搅匀，4号滤球自然滤过，分装于2 ml安瓿中，密封，100℃灭菌30 min，检查澄明度合格后备用。
       1.1.2  金银花精提取物注射液批号070330，自制。制备方法：取上述留样金银花醇沉液，加热挥尽乙醇，加5倍量水及鸡蛋清1个，充分搅拌后煮沸，再加0.2%活性炭，微沸10min，趁热滤过，冷藏24 h，滤过（除鞣、脱色、去树脂）。浓缩至3∶1（药材∶水）清膏，放冷，用6 mol·L-1盐酸调pH为2.0，以4倍量醋酸乙酯分4次萃取，分取醋酸乙酯液，用适量水洗涤1～2次（勿使pH过3.0），以5﹪氢氧化钠液调pH 6.0～6.5，分取水层，加热挥尽醋酸乙酯，加水至1 000 ml，高效液相测绿原酸含量，同样按每毫升含绿原酸3 mg投料，加注射用葡萄糖配制成金银花精提取物注射液。
       1.2  对照品
       1.2.1  阳性对照品牛血清白蛋白，规格5 g/瓶, 批号880802。中国科学院生物物理研究所中生公司生产。
       1.2.2  阴性对照品5﹪葡萄糖注射液，批号060923。四川美大康佳乐药业有限公司生产。
       1.3  动物Hartely豚鼠，普通级，雌雄兼用。购自重庆医科大学实验动物中心。合格证号：SCXK（渝）20020001， 重庆市实验动物管理委员会。
       1.4  环境动物实验在泸州医学院药理毒理实验室进行，温度：22～25℃。
       2  方法
       2.1  致敏动物检疫后，取体重250～350 g的健康豚鼠36只，雌雄兼用，按体重随机均分为6组：金银花精提取物高、低剂量组，金银花粗提取物注射液高、低剂量组，阴性、阳性对照组。致敏量实验组以绿原酸计分别为7.5 ，1.5 mg·kg-1，阳性对照组给牛血清白蛋白2.5 mg/只，阴性对照组给5%葡萄糖注射液2.5 ml·kg-1，均为腹腔注射(ip)，隔日1次，共3次。
       2.2  激发在末次致敏给药后第11天，分别静脉注射(iv)上述供试品的两倍量进行激发。静脉注射激发后立刻至30 min，按过敏反应症状表［8］详细观察记录每只动物的反应，症状的出现及消失时间，观察3 h。
       3  结果
       3.1  阴性对照组用5﹪葡萄糖注射液以5 ml·kg-1静脉注射激发后，有两只豚鼠5～8 min出现不安宁，其余豚鼠未见任何不适反应。
       3.2  阳性对照组用牛血清白蛋白以5 mg/只静脉注射激发后，15 s～5 min豚鼠主要表现为：不安宁、排尿、排粪、发抖、搔鼻、步态不稳、呼吸急促、呼吸困难、喘息、跳跃、痉挛、横转，40 s有1只动物死亡，另有两只分别于2，3 h死亡；未死动物于3 h后逐渐恢复正常。
       3.3  金银花精提取物注射液高剂量组以15 mg·kg-1静脉注射激发后，2～5 min有1只豚鼠出现排尿，另一只排粪，其余豚鼠未见任何不适反应。
       3.4  金银花精提取物注射液低剂量组以3 mg·kg-1静脉注射激发后，6只豚鼠未见任何不适反应。
       3.5  金银花粗提取物注射液高剂量组以15 mg·kg-1静脉注射激发后，5 s～3 min有4只豚鼠主要表现为呼吸困难、步态不稳、潮式呼吸，在40 s～5 min后死亡。有两只豚鼠30 s后出现不安宁、呼吸急促及步态不稳，10～15 min后症状逐渐消失，恢复正常。
       3.6  金银花粗提取物注射液低剂量组以3 mg·kg-1静脉注射激发后，有两只豚鼠2～5 min出现排尿、排粪，有5只豚鼠出现不安宁、发抖、搔鼻及呼吸急促，上述症状25 min后逐渐消失，恢复正常。
       3.7  结果评价计算过敏反应发生率，根据过敏反应程度、发生率及反应级数，进行综合判断［8～10］，如变态反应级数在2级以上，则判断为阳性反应。评判结果见表1。
       表1  金银花精提取物与粗提取物注射液豚鼠主动全身过敏实验结果（略）
       3.8  补充实验取健康未致敏豚鼠6只，分别进行以下实验：
       
       对2只健康未致敏豚鼠，静脉注射金银花精提取物注射液15 mg·kg-1（激发剂量），未出现任何过敏症状。
       
       对2只健康未致敏豚鼠，静脉注射金银花粗提取物注射液15 mg·kg-1（激发剂量），注射后10 s～2.5 min豚鼠主要症状为：不安宁、步态不稳、呼吸急促、痉挛、排尿和排粪，20～30 min恢复正常。
       
       对2只健康未致敏豚鼠，静脉注射金银花粗提取物注射液3 mg·kg-1（激发剂量），注射后1～2 min豚鼠出现不安宁、发抖，10～15 min逐渐恢复正常。补充实验评判结果见表2。
       表2  金银花提取物注射液对健康豚鼠的影响（略）
       *以绿原酸计
       4  讨论
          
       豚鼠静脉注射金银花精提取物注射液以绿原酸计1.5 mg·kg-1，已是临床成人最大剂量，激发量15 mg·kg-1，是成人最大剂量的10倍，豚鼠未出现过敏反应。虽有1只排尿，1只排粪，但过敏反应级数只有0.33，远未达到反应级数的2级［9，10］，且动物在排尿、排粪时没有失禁状态，属正常生理行为。因此，绿原酸、异绿原酸是致敏原的说法，是值得商榷和进一步探讨的。
       
       水煮醇沉制备的金银花粗提取物注射液，由于未经除鞣、脱色、水沉及酸碱转换有机溶剂萃取纯化工艺，以除去树脂、蛋白、黏液质等杂质，尽管绿原酸用量与精提取物注射液相同，而大小剂量组均出现阳性过敏反应。通过用健康未致敏豚鼠静脉注射金银花粗提取物注射液进行观察，同样出现强阳性反应，因此认为金银花粗提取物注射液引起的过敏症状属类过敏反应，不能判断为主动全身过敏反应。类过敏反应的特点是无免疫系统参与，即使首次用药也可诱发过敏反应，系药物直接刺激肥大细胞和嗜碱性粒细胞而释放大量组织胺，由此产生过敏反应症状，而不是抗原抗体反应。这和文献报道中药注射剂引起不良反应，66.3﹪均在首次用药出现是相一致的［5］。引起类过敏反应的原因，与金银花粗提取物中含有鞣质、蛋白质、树脂等杂质有关。实验表明，中药注射剂的提取纯化工艺必须改进，制剂质量标准必须提高。另外，临床使用时，也要严格按照各品种注射剂的说明书进行配制使用，不能随意增大剂量、改变稀释溶剂或任意与西药配伍合用。
       【参考文献】
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