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       【摘要】 
       目的观察荆防散干预炎症模型动物一氧化氮合酶-一氧化氮（NOS/NO）通路的抗炎机制，为其功效和临床应用提供药理学依据。方法采用角叉菜胶诱导大鼠胸膜炎模型和卵白蛋白致小鼠哮喘模型，测定大鼠胸腔渗出液与小鼠肺组织匀浆中NOS，iNOS活力和NO含量的变化。结果荆防散各剂量组能不同程度地降低小鼠肺组织匀浆与大鼠胸腔渗出液中NOS、iNOS活力，并减少NO含量，其中以5 g·kg-1剂量作用显著。结论荆防散能通过抑制NOS活力，尤其是与炎症反应密切相关的iNOS活力，从而减少炎症介质NO的生成来发挥抗炎作用，提示干预NOS/NO通路是其抗炎作用机制之一。
       【关键词】  荆防散； 抗炎； 一氧化氮合酶-一氧化氮通路
       Study on the Mechanism Related to the NOS/NO Pathway of Anti-inflammatory Action of JingFang San
       LIU Xiaoshuai ，ZENG Nan* ， LIANG Ke，ZHAO Lu，QU Liping,SONG Meifang，ZHANG Chongyan
       （Department of Pharmacology,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137;Departement of pharmaceutical non-clonical study Institute of Laboratory Animal Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People"s Hospital，Chengdu 610212 China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the mechanism related to NOS/NO pathway of anti-inflammatory action of JingFang San, and to pharmacological basis for its efficiency and clinical use of treating allergic inflammation disease.MethodsInflammated animal model were carried out by the carrageenan-induced pleurisy in rats and ovabumin-induced asthma in mice. Pleurorrhea in rats and lung tissue homogenate in mice were prepared for the detection of NOS activity and NO level.ResultsCompared with model group, JingFang San at the doses of 5，2.5 and 1.25 g·kg-1 could decrease the NOS activity and the NO level in inflammated area in different degree, and the suppressive effect was most significant at the dose 5g·kg-1 . ConclusionJingFang San has anti-inflammatory action in two animal inflammation models, which mechanism may be related to suppressing NOS activity, especially iNOS, and decrease the NO level.
       Key words：JingFang San；  Anti-inflammation；  NOS/NO pathway
        
       荆防散由荆芥和防风两味药材组成，具有发散风寒、祛风止痒之功效，应用于外感表证、过敏性鼻炎及过敏性皮炎等疾病的治疗。前期研究已证实荆防散具有良好的抗炎、抗过敏作用［1］。为进一步探讨其抗炎作用机制，本研究基于炎症性疾病发生时，一氧化氮（Nitric Oxide ，NO）生成的限速酶之一——诱导型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase ，iNOS）大量生成，而由iNOS产生的NO作为炎症介质广泛参与炎症、哮喘等疾病的病理发展过程的现代研究［2］，观察荆防散对炎症模型动物NOS/NO通路的影响来探讨其抗炎作用机制。
       1  材料与仪器
       1.1  药物荆防散提取液制备：按1∶1比例取适量荆芥与防风（荆芥Herba Schizonepetae，防风Radix Saposhnikoviae，均由我校卢先明教授鉴定符合药用标准），加10倍量水，参照2005年版《中国药典》Ⅰ部附录X“挥发油测定项”中甲法提取挥发油，挥发油另存，过滤药液，药渣按常规再煎煮2次，取滤液。合并3次滤液，浓缩，醇沉（乙醇含量60%），静置，过夜。过滤，回收乙醇。于浓缩液中加入挥发油，充分混匀，最终浓度为1 kg·L-1，4℃冷藏备用。参照2005年版《中国药典》Ⅰ部荆芥含量测定项，采用高效液相法测得荆防散中胡薄荷酮含量为64.74 mg·L-1。醋酸地塞米松片，天津太平洋制药有限公司产品，批号060201。
       1.2   动物昆明种小鼠，体重20～25 g；SD大鼠，体重200～260 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号分别为scxk（川）2004－15、scxk（川）2004-16。
       1.3   试剂角叉菜胶，sigma, Lot 17H1148；一氧化氮测试盒（硝酸还原酶法，批号20070913）、NOS测试盒（测分型，批号20070913），南京建成生物工程研究所产品。
       1.4  仪器Multiskan  MK3酶标仪，Thermolab systems；BS323S电子天平，Sartorious；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；980型超声雾化器，上海医械专机厂产品；SHIMAD20 SPD-10高效液相色谱仪。
       2  方法
       2.1  荆防散对卵白蛋白致哮喘模型小鼠的影响健康♂昆明种小鼠，按体重随机分为6组，分别为对照组、模型组及荆防散大、中、小（5，2.5，1.25 g·kg-1）剂量组及地塞米松组。除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组均于实验第1，7，15和21天分别iP卵白蛋白抗原液0.2 ml（含卵白蛋白100 μg、氢氧化铝1 mg）；实验第28天开始将小鼠置于钟罩内，以50 mg/L的卵白蛋白溶液（对照组用蒸馏水）雾化攻击，雾化速度可控且前后一致，1次/d，30 min/次，连续7 d。每次喷雾前30 min，正常对照组、哮喘模型组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组分别灌胃给予相应药物。各组小鼠于末次攻击后24 h处死，取肺组织用生理盐水制成10%匀浆，-75℃保存备用。按照试剂盒说明测定肺组织中NOS，iNOS活力与NO含量。
       2.2  荆防散对角叉菜胶致胸膜炎模型大鼠的影响健康♂SD大鼠，按体重随机分为6组，分组同实验“2.1”项。各组动物灌胃给药，1次/d，连续7 d。各组大鼠末次给药后30 min乙醚浅麻醉，于右胸腔注射1%角叉菜胶0.2 ml致炎（对照组注射等量生理盐水）。致炎后5 h，大鼠股动脉放血处死，打开胸腔，吸取胸腔渗出液，再用2 ml生理盐水冲洗胸腔，合并渗出液和冲洗液，3 000 r·min-1离心10 min，上清液-75 ℃保存备用。按试剂盒说明测定胸腔渗出液NOS，iNOS活力与NO含量。
       3  结果
       3.1   荆防散对卵白蛋白致哮喘模型小鼠的影响见表1。与对照组相比，模型组小鼠肺组织中的NOS，iNOS活力异常升高，同时NO含量显著增加，提示造模成功。与模型组比较，荆防散5，2.5，1.25 g·kg-1均能明显降低小鼠肺组织中NO含量（P＜0.05，P＜0.01），5，2.5 g·kg-1剂量明显抑制iNOS活力（P＜0.01，P＜0.05），且5 g·kg-1剂量对总NOS的活力亦显著抑制（P＜0.01）。
       表1  荆防散对卵白蛋白致哮喘模型小鼠肺组织中NOS，iNOS，NO水平的影响（略）
       与模型组比较，*P＜0.05, **P＜0.01
       3.2  荆防散对角叉菜胶致胸膜炎模型大鼠的影响  见表2。与对照组比较，模型组大鼠胸腔渗出液中NOS，iNOS活力显著升高，NO含量也显著增加，提示造模成功。与模型组比较，荆防散5，2.5 g·kg-1剂量能显著降低NOS活力（P＜0.01），5 g·kg-1剂量明显抑制iNOS活力（P＜0.01），且降低NO含量（P＜0.05）。
       表2  荆防散对胸膜炎模型大鼠胸腔渗出液中NOS，iNOS，NO水平的影响（略）
       与模型组比较，*P＜0.05, **P＜0.01
       4  讨论
          
       荆芥、防风均属辛温解表、祛风散寒之品。防风为“风药之润剂”，荆芥性虽温但较平和，两药相伍，相须为用，名曰“荆防散”，该药对不仅广泛用于外感表证，而且具有良好的祛风止痒之功，可用于各种与“风邪”相关的疾病，如麻疹透发不畅、风疹、湿疹等引起的皮肤瘙痒及过敏性鼻炎等过敏性炎症疾病的防治。现代药理研究表明，荆芥和防风均有解热、镇痛、抗炎、抗菌、抗病毒等作用。前期研究结果也证实，荆防挥发油、荆防散具有良好的抗炎、抗过敏作用［3］。为进一步探讨荆防散的抗炎作用机制，本研究采用卵白蛋白致小鼠哮喘模型及角叉菜胶致大鼠胸膜炎模型，观察药物干预NOS/NO通路的抗炎机制。
       
       NOS是一种与细胞色素P-450还原酶相似的含铁血红蛋白酶，目前发现NOS存在三种亚型，即内皮型（eNOS），神经型（nNOS）和诱生型（iNOS）。其中，eNOS，nNOS 又合称为原生型（cNOS），属于钙依赖性酶，在细胞处于生理状态时即有表达。其中，经eNOS产生的NO参与调节血压、器官的血流分布，抑制血小板的黏附和活化，抑制多核粒细胞的聚集；而由nNOS产生的NO参与脑的发育、学习和记忆等，若产生过量则对神经有损害作用。相反，iNOS 属于非钙依赖性酶，内毒素、白介素-1、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ均可诱导巨噬细胞等产生iNOS，由iNOS 催化产生的NO具有抗肿瘤、抗病原微生物等作用，然而iNOS一经诱导生成，即大量合成NO，过量的NO则参与炎症、休克、哮喘等病理过程的发生发展，由此可认为NOS（iNOS）/NO通路与炎症的发生发展密切相关。本研究发现，角叉菜胶致胸膜炎模型大鼠的胸腔渗出液与卵白蛋白致哮喘模型小鼠肺组织中NOS，iNOS活力及NO含量均明显升高，与文献报道相符［4～7］；且在小鼠哮喘模型中，小鼠雾化攻击后出现烦躁、呛咳、呼吸加快、活动量下降、时间稍长即死的典型哮喘症状［4］。可见，两个炎症模型复制成功，荆防散对以上指标的改善作用是其抗炎机制之一。
       
       此外，实验中发现荆防散5 g·kg-1能够显著降低两个炎症模型动物炎症区域NOS，iNOS活力及NO的含量，然而荆防散2.5 g·kg-1仅降低哮喘小鼠肺组织iNOS活力却对总NOS活力无影响，降低胸膜炎模型大鼠渗出液NOS活力却不影响iNOS活力，提示荆防散对两个模型的防治作用存在一定差异。研究报道，炎症反应过程中细胞内Ca2+浓度升高，从而使中性粒细胞发挥防御作用［8，9］，同时细胞内Ca2+浓度升高又能导致cNOS活性提高，作者推测这是导致两个炎症动物炎症区域总NOS活力增加的原因之一。另一个方面，哮喘模型小鼠与胸膜炎模型大鼠比较，后者炎症区域中性粒细胞渗出尤为突出［8，9］，故推测渗出液中Ca2+浓度亦增加显著。荆防散2.5 g·kg-1剂量对两个模型NOS，iNOS活性影响的差异，笔者认为这可能与荆防散降低胞内钙离子浓度，发挥抑制Ca2+依赖性的cNOS活力的作用，从而表现出其对胸膜炎模型大鼠总NOS活力的抑制作用强于哮喘模型小鼠。
       
       实验结果表明，荆防散的抗炎作用机制与影响NOS/NO炎症通路有关。其抗炎作用是否与影响花生四烯酸的代谢、影响细胞因子类炎症介质、影响钙离子的释放等有关，有待进一步深入研究。
       【参考文献】
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