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       【摘要】 
       目的选育四倍体伊犁贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk新种质，为高产、高生物碱含量的伊犁贝母育种打下基础。方法以鳞茎诱导出的不定芽为材料，将其接入含有2％二甲基亚砜、不同浓度秋水仙素的液体MS培养基诱导四倍体，利用处理后不定芽表型变化及染色体计数筛选鉴定四倍体伊犁贝母。结果成功获得了染色体加倍的伊犁贝母新材料，其中以含秋水仙素400 mg/L浸泡24 h效果最佳，四倍体诱导率达到33.3％，四倍体植株与二倍体对照相比，二者在表型性状、显微结构上有明显区别。结论四倍体植株体型大、生长优势明显，离体条件下利用不定芽诱导多倍体是伊犁贝母倍性育种的一条有效途径。
       【关键词】  伊犁贝母； 四倍体； 秋水仙素
       In vitro Induction of Tetraploid Fritillaria pallidiflora Schrenk
       LIU Chuanjun,WANG Xiaojun*,HAO Xiuying,LI Xiaojin,ZHAO Minan, ZHANG Shumin,CAO Yujin,YANG Liheng
       (Xinjiang Technical Institute of Physics & Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011,China;Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039,China; Institute of Microbiology, Xinjiang Academy of Agricultural Science，Urumqi 830091,China;Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethical Materia Medica, Urumqi 830002，China)
       Abstract：ObjectiveTo create new tetraploid resource of Fritillaria pallidiflora Schrenk in hope of potential cultivar with high bulb yield and high level of alkaloid．MethodsMultiple shoots induced from bulb pieces were used for tetraploid induction by immerging in colchicine solution of different concentrations．ResultsTetraploids were achieved successfully. The most efficient treatment for inducing tetraploid was soaking the shoot in 400 mg/L colchicine solution for 24 h, the inducing rate could be up to 33.3%．The induced tetraploids exhibited notable difference with control in morphology，physiology，and microscopic structure．ConclusionThe tetraploid fritillaria shows the advantages of gigantic size and vigorous growth．Thus, the established technical system to induce tetraploid from multiple shoots would provide an efficient alternative pathway for medicinal plants of Fritillaria pallidiflora Schrenk．
       Key words：Fritillaria pallidiflora Schrenk；  Tetraploid;  Colchicine
       
       伊犁贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk，百合科多年生草本植物，一味常用中药，以鳞茎入药，具有清热润肺、化痰止咳的功效，其有效成分主要是异甾体生物碱及其苷，尤以西贝素(imperialine)和西贝素苷(imperialine-3β-D-glucoside)为主要药效成分［1］。由于人工栽培繁殖系数低、品系退化［2］，野生伊犁贝母长期以来被大量采挖，分布面积日益缩减，资源破坏严重，已成为国家三级濒危保护植物，因此探求伊犁贝母新种质是科研工作的当务之急。
       
       多倍体植物由于染色体加倍，往往具有根茎叶的巨大性，能较好地满足药材生产的要求。同时植物染色体倍性的改变，导致部分基因表达活性的变化从而引起代谢产物含量的变化［3，4］。孙静贤等［5］综述了多种多倍体植物次生代谢产物较二倍体增加，L.DeJesus-Gonzalez等［6］报道四倍体黄花蒿Artemisia annua L.产生青蒿素（artemisinin）的量为二倍体的6倍。伊犁贝母是二倍体（2n=2x=24），多倍体诱变育种方面未见报道，本研究通过秋水仙素处理鳞茎切块诱导产生的不定芽，进行多倍体育种研究，以提高伊犁贝母鳞茎产量及药用成分的含量，克服栽培种品系退化问题。
       1  材料
          
       伊犁贝母鳞茎由新疆中药民族药研究所提供、鉴定。
       2  方法
       2.1  不定芽诱导与增殖 将伊犁贝母新鲜鳞茎用水洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒12～24 h，小鳞茎晾晒8～12 h ，然后将鳞茎在超净工作台上进行消毒处理，75％酒精30 s，0.1％升汞6～10 min，15％双氧水30～60 min，无菌水冲洗2～3次。处理后的鳞茎切成0.5 cm×0.5 cm大小，接入不定芽诱导培养基：MS＋KT 0.5～1.0 mg/L + NAA 0.1～0.4 mg/L，（20±1） ℃，2 000 lx，18 h/d培养。
       2.2  四倍体的诱导 将伊犁贝母不定芽切成单芽浸泡在2％二甲基亚砜、100～800 mg/L秋水仙素的液体MS培养基中，同时以单芽接入不加二甲基亚砜和秋水仙素的液体MS培养基作对照，均置于转速为100 r/min的摇床上处理 12～36 h，随后转入不含秋水仙素的液体MS培养基中100 r/min摇床培养4 h，再用无菌水冲洗2～3次后，接入MS固体空白培养基，每隔10 d重复上述处理1次，共处理3次，最后于无菌滤纸上约20 min晾干后转入：MS＋KT 0.5～1.0 mg/L + NAA 0.1～0.4 mg/L固体培养基中培养。
       2.3  四倍体筛选与染色体鉴定四倍体伊犁贝母的筛选与鉴定根据四倍体与二倍体在形态学上差异，不定芽生长势、叶宽、叶色、叶厚，解剖学上上表皮气孔大小及密度、保卫细胞叶绿体含量的差异筛选出疑似株。将疑似株转入生根培养基生根，待根尖长至0.2～0.5 cm时取疑似株幼嫩根尖和茎尖，采用薛恒钢等［7］常规压片法统计染色体条数：4 ℃下0.002 mol/L  8-羟基喹啉预处理4 h、卡诺固定液固定12～18 h，1 mol/L盐酸60 ℃解离8～10 min，改良苯酚品红染色液染色5～10 min，压片统计染色体数目。每个生根的不定芽取4个根尖，每个根尖统计20个分裂相细胞，茎尖统计20个分裂相细胞，记录染色体条数，根据统计的染色体数目确定四倍体伊犁贝母。
       3  结果
       3.1  不定芽诱导与增殖 鳞茎切块（图1 a）接入培养基10 d左右开始变绿，2～3周可观察到分化出的不定芽芽点（图1 b），40 d后不定芽可长至1～3 cm（图1 c）。KT：NAA≈3.5左右时，每个鳞茎切块可以分化出3～5个不定芽，根据不定芽生长情况适当提高KT浓度，两者浓度比在5.0时每个鳞茎切块可诱导产生5～7个不定芽（图1 b）。不定芽生长旺盛，保证了多倍体诱变的材料供应。
       图1  不定芽的诱导与诱导多倍体的单芽（略）
       3.2  四倍体诱导 经过3次秋水仙素诱变处理后，不同浓度秋水仙素及处理时间对伊犁贝母染色体加倍的影响见表1。 1号处理没能筛选到四倍体，7号处理诱导率最高，达到33.3％。低浓度秋水仙素对不定芽诱变作用不明显，100 mg/L秋水仙素处理12 h没有检测到染色体加倍的植株，处理36 h时四倍体诱导率只有2.6％，而低浓度（100，200 mg/L）处理随着处理时间延长四倍体诱变率提高幅度较大。高浓度的秋水仙素对不定芽的伤害大，致死作用强，秋水仙素浓度为800 mg/L时处理12 h死亡率达到30％，处理超过36 h时有过半不定芽死亡，而四倍体诱导率只有15.8％。在四倍体诱变过程中由于秋水仙素对处理材料既有染色体诱变加倍作用又有较强的毒害作用，因此伊犁贝母四倍体诱变育种中，必须结合考虑秋水仙素诱变作用和毒害作用。本实验综合考虑这两个方面因素得出含有2％二甲基亚砜，秋水仙素浓度为400 mg/L的液体MS培养基中浸泡24 h为最佳处理方法。
       表1  不同浓度及处理时间对伊犁贝母染色体加倍的影响（略）
       诱变率：加倍植株数/（处理不定芽数-死亡芽数）
       3.3  四倍体筛选与鉴定 经诱变处理3周后部分不定芽死亡，存活下来多倍体不定芽初期生长缓慢，培养两个月后产生的叶片在外观形态上与对照组有较大的差别（图2）：四倍体不定芽叶片宽而厚、叶面颜色稍深；在组织解剖观察上与二倍体相比气孔大、密度小，在400倍显微镜下气孔保卫细胞所含叶绿体较对照多（图3～4）等明显的多倍体性状。根据处理后与对照在表型上的差异及气孔特性可以排除60％左右染色体未加倍的植株，筛选出疑似株。通过茎尖与根尖染色体分析，二倍体细胞染色体2n=2x=24，四倍体为2n=4x=48，共统计100个中期分裂细胞，确定四倍体植株。见图5～6。
       图2  生长两个月的二倍体（a）与四倍体（b）表型差异（略）
       图3  二倍体气孔（略）         
       图4  四倍体气孔（略）
       图5  二倍体染色体 2n＝2x＝24（略）   
       图6  四倍体染色体 2n＝4x=48（略）
       4  讨论
          
       本研究确定了伊犁贝母四倍体诱变育种的可行方法。伊犁贝母种子萌发困难，籽苗生长势弱，人工栽培极少用种子繁殖，多数用鳞茎繁殖。植株每年生长70～80 d，地面茎杆便枯萎死亡，地下鳞茎顶芽在夏末至中秋进行分化活动，奠定翌年营养苗形态结构的全部组分［8］，因此在自然生长条件下利用秋水仙素处理地上部分诱导四倍体伊犁贝母很难实现。本研究利用诱导鳞茎切块产生的大量不定芽为处理材料，通过秋水仙素处理不定芽诱导四倍体伊犁贝母有效克服了自然出芽时，地上部分形态结构已经确定，诱变处理很难使地下鳞茎染色体加倍的限制。同时由于伊犁贝母地上部分生长期短，利用秋水仙素处理自然气候下的材料季节限制无法避免，而利用秋水仙素处理离体条件下诱导产生的不定芽，避免了伊犁贝母多倍体育种的季节限制。
       
       在多倍体诱导过程中，秋水仙素处理后的不定芽转入不含秋水仙素的液体MS培养基中有利于秋水仙素的释放，降低了幼嫩不定芽受到的毒害，因此在诱变效率33.3％时，仍可以保证存活率达到75％（见表1）。利用低浓度的秋水仙素处理不定芽，对于染色体的加倍是有利的，但多倍体筛选鉴定的工作量大。高浓度的秋水仙素对不定芽毒害作用强，死亡率高，但筛选鉴定多倍体的工作量较低。在倍性鉴定过程中通过染色体倍性检测，将根尖与幼嫩不定芽茎尖染色体统计相结合，有效避免了只利用根尖作为植株倍性参考指标时嵌合体难排除的困难。四倍体伊犁贝母由于染色体加倍，鳞茎产量可能增加，同时染色体倍性的变化可能获得生物碱含量高的伊犁贝母植株，从而缓解野生伊犁贝母破坏严重，人工栽培种品系退化问题。通过对获得的四倍体植株作进一步筛选，获得鳞茎产量高、有效成分含量高的伊犁贝母新品种，是今后还要进行的研究课题。
       【参考文献】
         ［1］ 王林辉，季 晖，王长礼 ，等. 伊犁贝母总生物碱的药效学研究［J］.中国药科大学学报，2003 ，34：172.
       
       ［2］ 唐生斌，唐小鹏. 贝母类药材的性状鉴别［J］.中药材，2002，25（5）：321.
       
       ［3］ 武振华，牛炳韬，王新宇.药用植物染色体加倍的研究进展［J］.西北植物学报，2005：25.
       
       ［4］ 程治军，秦瑞珍，张 欣，等.多倍体化引起植物表型突变的分子机理研究［J］.作物学报，2005,31(7) ：940.
       
       ［5］ 孙静贤，丁开宇，王兵益.植物多倍体研究的回顾与展望［J］.武汉植物学研究，2005，23（5）：482.
       
       ［6］ L.DeJesus-Gonzalez，P.J.Weathers. Tetraploid Artemisia annua hairy roots produce more artemisinin than diploids［J］. Plant Cell Rep 2003，21：809.
       
       ［7］ 薛恒钢，周 颂，王 强，等. 秋枫属的染色体数目及其进化意义 云南植物研究［J］.2007，29（2）：193.
       
       ［8］ 张兰芳. 伊贝母种子萌发和籽苗建立［J］.西北植物学报，1993，13(2) ：140.