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       【摘要】 
       目的观察欧亚旋覆花总黄酮（total flavones extracted from Inula britannica L， TFIB）对大鼠局灶性脑缺血-再灌注脑组织损伤的保护作用，并进一步探讨其作用机制。方法采用大脑中动脉栓塞法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，缺血2 h，再灌注22 h后，以盐酸2, 3, 5三苯基四氮唑（TTC）染色法测定脑梗塞面积,比色法测定脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,采用“5分法”进行神经症状评分。 结果TFIB (25，50，100 mg· kg-1，ip) 能明显改善脑缺血-再灌注后大鼠神经症状,明显减小梗塞面积与全脑面积之比，提高缺血脑组织SOD活性，降低MDA含量。结论TFIB 对大鼠缺血-再灌注损伤大脑具有显著的保护作用,其作用机制可能与TFIB抗氧化作用有关。
       【关键词】  欧亚旋覆花总黄酮； 脑缺血再灌注； 抗氧化
       Protective Effects of Total Flavones Extracted from Inula britannica L. on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats
       GENG Hongmei, QI Jinlong
       (Hengshui College, Hengshui, 053000, China; Hebei Medical University, Shjiazhuang 050017, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effects of total flavones extracted from Inula britannica L.(TFIB) on cerebral ischemia -reperfusion injury in rats and its mechanism.MethodsThe model of focal reperfusion injury after cerebral ischemia in rats was made by middle cerebral artery occlusion. For 2h, followed by 22 h reperfusion. The infarction area of brain was assessed in brain slices stained with 2% solution of 2, 3, 5-triphenyl tetrazolium chloride. Spectrophotometric assay was used to determine the activity of superoxide dismutase ( SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in brain tissue. Neurological deficit was evaluated by using a 5-point neurological function scoring system.ResultsTFIB (25, 50, 100 mg·kg-1, ip) significantly decreased neurological deficit scores and reduced the percentage of infarction in the ip silateral hemisphere compared with the model group. TFIB significantly increased SOD activity and decreased MDA content.ConclusionTFIB provides significant protection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.
       Key words:Total flavones extracted from Inula britannica L.;   Cerebral ischemia-reperfusion;   Antioxidant action
       
       缺血性脑损伤是以微循环下降为特征的神经系统疾病。临床上脑缺血发生后, 大部分患者还有血流再灌注现象发生, 当血流再灌注时会产生大量的自由基, 导致体内脂质过氧化反应, 形成一系列的脂质自由基及其降解产物。这些脂质自由基将进一步引起膜的流动性降低、通透性增高、线粒体肿胀、溶酶体损坏及释放。因此, 自由基损伤比单纯脑缺血损伤更加严重［1］。现有的许多钙拮抗剂只能治疗单纯脑缺血损伤，而对再灌注损伤无很好地治疗作用。研究证明自由基清除剂和抗氧化药物可以减轻缺血性脑损伤，产生神经保护作用［2，3］。黄酮类化合物具有清除自由基和抗应激反应的能力。欧亚旋覆花含有槲皮素、木犀草素、槲皮苷等多种黄酮类化合物，具有抗氧化活性［4，5］。然而有关欧亚旋覆花总黄酮( total flavones extracted from Inula Britannica L., TFIB)对脑缺血-再灌注损伤的作用,目前尚无报道。本实验采用大鼠大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,观察TFIB对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤大脑的保护作用。
       1  材料
       1.1  药品与试剂欧亚旋覆花总黄酮提取物（自制）；SOD及MDA试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所）；2, 3, 5-三苯基四氮唑( 2, 3, 5-triphenyl tet2razolium chloride, TTC) ,其他试剂为进口或国产分析纯。
       1.2  动物健康雌性SD大鼠，体重230～270 g，由河北医科大学实验动物中心提供，清洁II级，动物合格证号：冀医动字第06057号。
       2  方法
       2.1  欧亚旋覆花总黄酮的制备取欧亚旋覆花适量加10倍量水，回流提取3 次，1 h/次，合并提取液浓缩；然后用AB-8大孔吸附树脂柱富集，提取物上样浓度为0.2 g/ml，用70%乙醇进行洗脱，冷冻干燥，测得总黄酮含量为89.5%。
       2.2  MCAO模型的制备［6～9］SD大鼠以10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 ml/100 g体重），沿正中纵向剪开颈前皮肤,游离右侧颈总动脉( common carotid artery, CCA) 、颈外动脉(external carotidartery, ECA)及颈内动脉( internal carotid artery, ICA) ,将尼龙线(外涂硅胶,头端直径为0.26～0.30 mm)沿ECA 插入ICA 约18 mm(从ECA，ICA分叉处算起)堵住大脑中动脉头端。缺血1.5 h后,抽出尼龙线进行再灌注22 h。
       
       进行行为评分参考Zea Longa 的5分制评分标准：① 0分：正常，无神经损伤症状；② 1分：对侧前爪部分屈曲或完全屈曲；③ 2分，向偏瘫侧转圈；④  3分，向偏瘫侧倾倒；⑤ 4分，不能自发行走，意识丧失。
       2.3  分组与给药将造模成功的动物随机分为5 组，即假手术组、模型组和TFIB 不同剂量组( 25, 50，100 mg·kg-1 )。假手术组、模型组在MCAO 前1.5 h 通过腹腔注射( ip ) 给予溶剂，不同浓度的TFIB 均在MCAO前1.5 h给予( ip )。
       2.4  神经症状评分及大脑梗塞面积的测定模型组在MCAO 前1.5 h 通过腹腔注射( ip ) 给予溶剂。不同浓度的TFIB 均在MCAO前1.5 h给予( ip ) 。存活大鼠再灌注6，12，22 h后观察大鼠行为变化,按“5分法”进行神经症状评分，然后立即断头取脑,去除小脑及脑干,将大脑沿冠状面切成2 mm 厚的脑片，于2%TTC溶液中染色,用Image J (美国NIH)分析软件计算梗塞面积与全脑面积之比。
       2.5  丙二醛（MDA）含量的测定MCAO模型制备如前。大鼠断头后,于冰浴中迅速分离脑组织,去除小脑及脑干,取缺血半脑组织及相应对侧半脑组织分别称重,按1:10比例(每克组织加10 ml生理盐水)加入冰冷生理盐水,用内切式组织匀浆机分别制成10%组织匀浆,离心10 min (3 000 r·min-1)，并用生理盐水将上清液稀释成1%组织匀浆,测定按试剂盒使用说明操作，于532 nm处测OD值，按MDA测试盒计算方法计算MDA含量，比较各组有无显著性差异。
       2.6  脑组织超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定MCAO模型制备如前。大鼠断头后,于冰浴中迅速分离脑组织,去除小脑及脑干,取缺血半脑组织及相应对侧半脑组织分别称重,按1∶10比例(每克组织加10 ml生理盐水)加入冰冷生理盐水,用内切式组织匀浆机分别制成10%组织匀浆,离心10 min (3 000 r·min-1)，并用生理盐水将上清液稀释成1%组织匀浆,测定按试剂盒使用说明操作，于550 nm处测OD值，按SOD测试盒计算方法计算SOD含量，比较各组有无显著性差异。
       2.7  统计学处理实验数据以±s表示，多组数据间比较采用单因素方差分析（ANOVA），Dunnett T 两两比较，SPSS10.0数理统计软件处理。
       3  结果
       3.1  神经功能评定　模型组 MCAO 大鼠神经症状评分明显高于假手术组。与模型组相比,TFIB (25, 50, 100 mg·kg-1,ip) 能明显降低神经症状评分,并呈浓度依赖性。见表1。
       表1  TFIB对脑缺血1.5 h，再灌22 h后大鼠神经症状评分的影响（略）
       与模型组比较，*P<0.05；n=6
       3.2  TFIB对脑梗塞面积的影响模型组MCAO大鼠脑梗塞面积明显高于假手术组。与模型组相比,经TFIB(25，50，100 mg·kg-1，ip)预处理的大鼠脑缺血-再灌注后,其脑梗塞面积较模型组明显缩小，且 TFIB减小梗塞面积的作用呈剂量依赖性。结果见表2。
       表2  大鼠脑缺血再灌注后脑梗塞面积比较（略）
       与模型组比较，*P<0.05；n=6
       3.3  TFIB对脑组织MDA含量的影响与模型组相比，TFIB(25，50，100 mg·kg-1)均能明显抑制MDA含量的升高。结果见表3。
       4  讨论
          
       缺血性脑中风是临床常见病、多发病,死亡率及致残率极高，研究开发此类疾病的保护性药物具有重要的临床意义。本研究采用MCAO模型观察TFIB对大鼠缺血-再灌注大脑的影响。结果表明，TFIB能明显改善脑缺血-再灌注后大鼠的神经功能症状，明显减小脑梗塞面积，提示TFIB对大鼠缺血-再灌注损伤大脑具有保护作用。
       表3  TFIB对脑缺血-再灌注大鼠脑组织MDA含量的影响（略）
       与模型组相比，*P﹤0.01；n=6
       3.4  TFIB对脑组织SOD活性的影响与模型组相比，TFIB(25，50，100 mg·kg-1)均能明显抑制SOD活性的降低。结果见表4。
       表4  TFIB对脑缺血-再灌注大鼠脑组织SOD活性的影响（略）
       与模型组相比，*P﹤0.01；n=6
       
       脑缺血再灌注损伤的发生机制很多,如兴奋性氨基酸增多、细胞内钙离子超载、氧自由基损伤等, 其中氧自由基损伤在脑血管疾病的发生过程中起着重要作用。脑组织缺血缺氧时，会产生大量的自由基，由于脑组织富含多不饱和脂肪酸，缺血缺氧产生的自由基攻击多不饱和脂肪酸，导致体内脂质过氧化水平增高，引起神经细胞膜、亚细胞膜的结构破坏。MDA是脂质过氧化反应的产物，其含量的高低反映了脑内自由基引起脂质过氧化的水平，因而，测定MDA含量可间接地反映出细胞受损的程度。机体抗氧化防御酶系统包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等。当体内自由基大量产生时，使体内抗氧化酶如SOD过量消耗而导致SOD活性下降。本实验研究结果表明，大鼠缺血-再灌注后，SOD活性显著下降，MDA含量显著升高，表明缺血再灌注过程中产生大量自由基损伤机体。TFIB可以降低脑组织中的MDA含量，提高SOD活性，提示TFIB有较强的清除自由基和抗氧化活性。
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