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       【关键词】  高效液相
        摘要：目的：建立测定枸杞子中氨基酸含量的高效液相色谱方法，并测定不同产地枸杞子中氨基酸的含量。方法：Hypersil AAODS色谱柱(2.1 mm×200 mm 5μm)，A液与B液溶剂系统梯度洗脱，检测波长330 nm，柱温：40℃。结果：不同产地枸杞子中氨基酸的含量与氨基酸种类有较大差别。线性范围：12.5～50 pmol/μl，平均回收率在96.3%～103.8%之间。结论：该方法快捷、稳定、重复性好，可用于枸杞子及其制剂中氨基酸含量的测定。
        关键词：枸杞子；氨基酸；HPLC
        Determination of Amino Acid in Lycium barbarum L. from Different Areas by HPLC
        BAI Xuemei, TIAN Jiaming*, WANG Debao
        (Laboratory Center of Hebei North University, Zhangjiakou 075029, China)
        Abstract:Objective:To establish a HPLC method for the quantitative analysis of amino acid in Lycium barbarum L.Methods:The chromatographic column was Hypersil AAODS (2.1 mm×200 mm， 5μm)，gradient elution using A and B solvent system, UV detection wavelength was 330 nm,the temprature of column wes 40℃.Results:The content and kinds of amino aciare different from different places ,the linear ranges was 12.5～50 pmol/μl ,the average recovery rate was 96.3%～103.8%.Conclusion:This method is fast, reliable and accarate.It can be used for determination of the Lycium barbarum L.
        Key words:Lycium barbarum L.;Amino acid;HPLC
        枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，其主要活性成分除枸杞多糖外，还含有多种氨基酸。在生命活动中起着极为重要的作用，由于其具有调节免疫功能，抗衰老，保肝补肾等多种功效［1］，使其应用范围越来越广。氨基酸的检测方法多种多样［2］。本实验建立了测定枸杞子中氨基酸含量的HPLC柱前衍生法，并测定了不同产地枸杞子中氨基酸的含量，进一步了解其含量与组成成分， 为枸杞子药材的入药与其优劣的鉴别提供相关依据，为枸杞子药材及其相关制剂的质量控制奠定基础。
           1仪器与试剂
        1.1仪器HP1100高效液相色谱仪(Agilent 公司)包括：四元泵、在线脱气机、VWD检测器；分析天平(1/10万，日本)，超声波清洗器。
        1.2试剂A液：称取2.720 0 g含有三个结晶水的乙酸钠，放入1500 ml的烧杯中加入1 000 ml三蒸水，使其完全溶解，然后加入180 μl三乙胺，用1%～2%的醋酸调pH=7.2±0.05，再加入3.0 ml四氢呋喃，混匀，过0.45 μm滤膜。
B液：称取2.720 0 g含有三个结晶水的乙酸钠，放入1 500 ml的烧杯中，加200 ml的三蒸水，使其完全溶解，用1%～2%的醋酸调pH=7.2±0.05，再加入400 ml甲醇和400 ml乙腈，混匀，过0.45　μm滤膜。
        邻苯二甲醛(OPA)：精密称取0.200 0 g OPA，用5 ml甲醇溶解，加入200 μl β巯基乙醇，混匀，用0.4 mol/L的硼砂缓冲液定容至50 ml，放入棕色瓶中，置4℃冰箱备用。
        氨基酸标准品(含17种氨基酸)购于Agilent公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，(Agilent公司)。
           2方法与结果
        2.1色谱条件
        2.1.1OPA衍生法待检样本200 μl，加入200 μl OPA，混匀，过0.45 μm微孔滤膜，在5 min内进样20 μl。
        2.1.2色谱条件色谱柱：Hypersil AAODS柱(2.1 mm×200 mm 5μm)，检测波长：330 nm，柱温：40℃，梯度洗脱条件见表1。
        表1梯度洗脱条件（略）
        2.2供试品溶液制备称取已干燥粉碎的宁夏、内蒙、河北、张家口四产地枸杞子细粉10.000 g，置于50 ml具塞锥形瓶中，加入70%乙醇，浸泡4 h，50℃超声提取30 min，滤出提取液重新加入70%乙醇，超声提取30 min，合并两次提取液，减压浓缩定容至50 ml，进样前过0.45 μm滤膜。
        2.3方法学考察
        2.3.1标准曲线制作精密吸取氨基酸标准品(100 pmol/μl)0.5 ml用0.1N HCL作2，4，6，8倍稀释，每个稀释度按上述色谱条件进样20 μl，测定峰面积，结果以浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，做标准曲线，得回归方程，色谱图见图1。
        2.3.2精密度实验精密吸取标准品溶液20 μl，连续进样5次，按上述色谱条件测定其峰面积，计算RSD为：0.8%～1.8%。
        2.3.3重复性实验取宁夏样品5份，按“3”项下制备供试品溶液，每份分别进样20 μl，按上述色谱条件测定其峰面积，计算RSD为1.2%～2.8%。
        2.3.4加样回收率实验取已知含量的宁夏样品20 μl，精密加入5，10，15，20 μl氨基酸标准品，依照上述色谱条件进样，结果平均回收率(n=5)分别为：96.3%～103.8%。
        2.4样品测定四产地枸杞样品各平行取3份，依照上述色谱条件进样，测得的氨基酸含量见表2，色谱图见图1(只给出宁夏)。
a氨基酸标准品的色谱图b宁夏枸杞子中氨基酸的色谱图
        图1枸杞子中氨基酸的色谱图（略）
           3讨论
        在实验过程中，我们比较了不同pH值的流动相。结果表明，pH=7.20±0.05时，出峰时间适宜且各个峰的分离最好。
因OPA衍生时间对实验影响较大，所以进样时间应控制在5 min以内。
在四产地中，宁夏产枸杞子中氨基酸总含量及人体必需氨基酸的含量最高，在所含氨基酸的种类上，宁夏枸杞子明显优于其他产地，这可能与其地域、气候及采摘时间有关。
        表2枸杞子氨基酸含量测定（略）
           参考文献：
        ［1］杨云，张晶，陈玉婷，等.天然药物化学成分提取分离手册，第2版［M］.北京：中国中医药出版社，2003，1：506508.
        ［2］李美发.医药高效液相色谱技术，第1版［M］.北京：人民卫生出版社，1999：107122.
        (河北北方学院实验中心，河北 张家口075029)