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       【摘要】 
       目的测定丹皮酚在肾气丸各拆方组水煎液中的含量，分析肾气丸“阴中求阳”配伍对丹皮酚含量的影响。方法将肾气丸组方药物拆方分为补阳组1、补阳组2、补阴组1、补阴组2、阴阳双补组1和阴阳双补组2（即肾气丸全方），采用高效液相色谱法测定各肾气丸拆方组水煎液中丹皮酚的含量。结果阴阳双补组2水煎液中丹皮酚含量高于补阳组2和阴阳双补组1；阴阳双补组1和补阳组2水煎液中丹皮酚含量高于补阳组1，且都具有统计学意义。结论肾气丸“阴中求阳”配伍能增大水煎液中丹皮酚的含量，且肾气丸中的“三泻”药物（茯苓、泽泻、丹皮）也有增强此作用的趋势。
       【关键词】  肾气丸； 阴中求阳； 丹皮酚； 高效液相色谱法
       Influence of Compatibility of Shenqi Pill  with“Reinforcing Yang from Yin” on the Content of Paeonol
       LI Zhengmu，ZHUO Lianjia，CHEN Weixuan*，WU Yong
       （Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China）
       Abstract：ObjectiveTo detect the content of paeonol in decoction of each dismantled drug group, and to analyze the influence of compatibility of Shenqi Pill with“reinforcing Yang from Yin” on the content of paeonol in each decoction.MethodsThe drug of Shenqi Pill was divided into invigorating Yang group Ⅰ, invigorating Yang groupⅡ, invigorating Yin group Ⅰ, invigorating Yin group Ⅱ, invigorating Yin-Yang group Ⅰ, invigorating Yin-Yang group Ⅰ and the content of paeonol in each dismantled Shenqi Pill decoction was measeured by using the method of high performance liquid chromatogram. ResultsThe invigorating Yin group Ⅱ and the whole Shenqi Pill group possessed high content of paeonol, and the content of invigorating Yang group was the least.ConclusionPaeonol is likely to be one of the effective constituent of the compatibility of Shenqi Pill with“reinforcing Yang from Yin” .
       Key words： Shenqi Pill;   Reinforcing Yang from Yin;   Paeonol;  High performance liquid chromatogram
       
       肾气丸始载于《金匮要略》，由桂枝、附子、干地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮组成，有温补肾阳之功效，是临床治疗肾阳虚证的名方。其“阴中求阳”的组方原理，即在大量滋阴补肾的药物中加入少量的附子、桂枝，是方剂现代研究中值得探讨的课题。本研究将肾气丸的组方进行拆分，以丹皮酚的含量为指标，对肾气丸各拆方组水煎液中丹皮酚的含量进行比较研究。现报道如下。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器DIONEX P680 高效液相色谱仪；UVD170U型紫外可见光检测器；Chromeleon工作站；分析天平；超声清洗仪。
       1.2  试剂 乙醚；甲醇；水；乙腈（色谱纯）；其他试剂均为达到色谱分析标准。
       1.3  对照品 丹皮酚（中国药品生物制品检定所，批号为110708-200505）。
       1.4  药材桂枝、附子、干地黄、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮均由广州中医药大学中药鉴定教研室张丹雁教授鉴定为正品。
       2  方法与结果
       2.1  拆方分组将肾气丸组方药物分为补阳组1：附子，桂枝；补阳组-2：附子，桂枝+茯苓，泽泻，丹皮；补阴组1：干地黄，山茱萸，山药；补阴组2：干地黄，山茱萸，山药＋茯苓，泽泻，丹皮；阴阳双补组1：附子，桂枝＋干地黄，山茱萸，山药；阴阳双补组2：即肾气丸全方。其中含有牡丹皮的组有：补阳组2，补阴组2，阴阳双补组-2。
       2.2  高效液相色谱条件  色谱柱 DiomonsilTM C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温为室温；流动相为乙腈水（50：50），流速1 ml/min；检测波长274 nm；进样量10 μl。
       2.3  标准曲线制备   精密称取丹皮酚对照品23.3 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度（每毫升含丹皮酚0.466 mg），作为对照品储备溶液。分别精密量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得不同浓度的丹皮酚对照品溶液，取上述标准溶液，按文中报道的色谱条件分别进样10 μl测定， 以丹皮酚标准液浓度为横坐标（C），峰面积为纵坐标（A），得回归方程A= 0.769C - 0.352 9，r= 0.999 9 丹皮酚在3.728 ～ 22.368 μg/ml内线性关系良好，符合外标法定量测定要求。
       2.4  供试品溶液的制备 精密称取各肾气丸拆方组含丹皮6 g（以桂枝、附子、干地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮1∶1∶8∶4∶4∶3∶3∶3的比例计算），浸泡30 min，煎煮60 min，得药液约15 ml，用乙醚萃取两次（15 ml/次）， 室温挥干乙醚，残渣用甲醇溶解定容至5 ml，用0.45 μm的有机微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
       2.5  精密度实验    取对照品溶液，连续进样测定，根据所得峰面积计算，RSD= 1.05%（n=6）。
       2.6  稳定性实验 取供试品溶液在室温下放置，每隔2h测定1次，共进样5次。结果表明，丹皮酚峰面积积分值在8 h内稳定。补阳组2    RSD= 1.46%，补阴组2 RSD= 1.3%；阴阳双补组2 RSD= 0.74%（n= 5）。
       2.7  阴性对照实验   肾气丸全方按照含丹皮6 g的比例称取不含丹皮的其它药物，按照上述供试品制备方法，制作阴性供试品溶液，用与样品测试相同的色谱条件测定，在与样品相同保留时间处无干扰峰。结果见图1～3。
       图1  丹皮酚对照品HPLC图（略）
       图2  肾气丸全方HPLC图（略）
       图3  肾气丸缺丹皮阴性对照HPLC图（略）
       2.8  样品测定按照含量测定方法测定各拆方组的样品，记录峰面积，计算丹皮酚在各拆方组中的含量，用SPSS统计软件进行分析。结果见表1，色谱图见图4～7。
       表1  样品含量测定结果（略）
       与补阳组1比较，** P＜0.01；与补阴组2比较，△P＞0.05
        
       实验结果显示以补阴组2与阴阳双补组2（肾气丸全方）水煎液中丹皮酚含量较高，而以桂枝、附子配伍“三泻”（茯苓、泽泻、牡丹皮）水煎液中丹皮酚含量较低。阴阳双补组水煎液中的含量明显高于补阳组，且有统计学意义，虽然补阴组-2含量较阴阳双补组偏高，但并无统计学意义。
       图4  丹皮酚对照品HPLC图（略）
       3  讨论
          
       本实验流动相试用了乙腈水（70：30）、乙腈水（40：60）、乙腈水（50：50）系统，检测波长参照药典选择274 nm，结果以乙腈水（50：50）系统分离效果最优，出峰时间约为11 min。参照《中国药典》2005版（第Ⅰ部），按照高效液相色谱法进行了系统适应性实验，为使丹皮酚达到基线分离，丹皮酚理论塔板数不低于3 500，而本实验测定各拆方肾气丸组水煎液中丹皮酚的理论塔板数均达到8 000以上。
       图5  补阳组2 HPLC图（略）
       图6  补阴组2 HPLC图（略）
       图7  阴阳双补组2（肾气丸全方）HPLC图（略）
       
       实验结果显示以补阴组2与阴阳双补组2（肾气丸全方）水煎液中丹皮酚含量较高，而以桂枝、附子配伍“三泻”（茯苓、泽泻、牡丹皮）水煎液中丹皮酚含量较低。阴阳双补组水煎液中的含量明显高于补阳组，且有统计学意义，虽然补阴组-2含量较阴阳双补组偏高，但并无统计学意义。从本实验结果来看，干地黄、山茱萸、山药有助于丹皮酚在水煎液中的溶出。
       
       中医学认为阴阳互根互用，而“孤阴不生，独阳不长”。张景岳提出“善补阳者必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷”。肾阳虚证若单用大量的温补肾阳的药物不仅虚不受补且反有助热之弊，而滋阴补肾药中加入少量的温阳药，以阴中求阳来治疗肾阳虚证则效果良好。肾气丸的组方配伍特点正是在大量的滋阴补肝肾的药中加入少量温阳的桂枝、附子，即“阴中求阳”，意在微微生火，以“少火生气”鼓舞肾阳来治疗肾阳虚证。
       
       丹皮苦辛寒，长于入血分清泻肝火，配伍肾气丸方中，使滋阴药滋而不腻，使温阳药补阳而不动相火。丹皮酚是丹皮的有效成分之一，《中国药典》规定［1］桂附地黄丸中所含牡丹皮以丹皮酚计，水蜜丸每克不得少于0.80 mg，小蜜丸每克不得少于0.60 mg，大蜜丸每丸不得少于5.40 mg。有研究显示［2］丹皮酚有促进IL-2及TNF-α生成的作用。
       
       对肾阳虚证的现代研究发现［3］，肾阳虚证具有下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴不同环节(层次) 、不同程度的功能紊乱，肾阳虚证与神经内分泌免疫网络有内在联系，补肾药是调节下丘脑、神经内分泌免疫网络、下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的有效手段, 肾阳虚证涵盖着神经内分泌免疫网络。IL2被认为是一种重要的神经及神经内分泌系统的调节因子，可调节多种下丘脑、垂体神经肽的释放如ACTH、GRF、CRF及加压素(AVP)的释放，并使血浆中可的松、ACTH水平增高，诱发HPA轴的激活［4］。TNFα对肾上腺轴的影响是通过两条途径完成的，一是通过影响垂体ACTH的分泌而间接影响肾上腺皮质的功能，另外是直接作用于肾上腺皮质而影响其分泌活动［5］。
       
       综上所述，丹皮酚通过促进IL2及TNFα的生成，来调节机体神经内分泌系统以改善肾阳虚证。结合本实验结果，“阴中求阳”的肾气丸水煎液中丹皮酚的含量较纯补阳组高，而以桂枝、附子配伍“三泻”（茯苓、泽泻、牡丹皮）组水煎液中丹皮酚含量较低，且有统计学意义。实验结果提示肾气丸“阴中求阳”的配伍可能是通过丹皮酚促进IL2及TNFα的生成，调节机体神经内分泌系统，激活下丘脑-垂体-肾上腺轴来改善肾阳虚证，故丹皮酚可能是肾气丸“阴中求阳”的配伍在治疗肾阳虚证中的有效成分之一。
       【参考文献】
         ［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：557.
       
       ［2］ 孙国平，沈玉先，张玲玲，等.丹皮酚对HepA荷瘤小鼠免疫调节和抑瘤作用研究［J］.中国药理学通报,2003,19(2)：16.
       
       ［3］ 沈自尹.从肾本质研究到证本质研究的思考与实践［J］.上海中医药杂志，2000，34（4）：4.
       
       ［4］ 王建明.IL2神经及免疫系统的调节因子［J］.海南医学，2006，17（9）：154.
       
       ［5］ 谢启文.现代神经内分泌学［M］.上海：上海医科大学出版社，1999，9：351.