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       【摘要】 
       目的确定体外消化透析法测定朱砂中汞的生物可接受率的实验条件，建立实验流程，并测定朱砂中汞的生物可接受率。方法模拟胃肠消化环境，研究pH、接触时间等因素对朱砂中汞的溶出率及透析时间等对朱砂中汞的生物可接受率的影响规律，确定合适模拟条件。结果确定的实验流程模拟条件为：液/固比100，人工胃液pH=1.5，加入0.16%胃蛋白酶1 ml，接触时间100 min，透析时间100 min，加入胰液胆盐混合物量为5 ml。在确定的实验条件下，CV-AFS测得水飞朱砂中汞的溶出率为2.5×10-6（n=6，RSD＝4.1％），生物可接受率为4.8×10-7 (n=6，RSD＝3.5％)。结论体外消化透析法可用于测定朱砂中汞的生物可接受率，可为测定含朱砂中成药中汞的生物可接受率提供方法学上的参考。
       【关键词】  体外消化透析法； 朱砂； 生物可接受率； 汞
       Determination of the Experimental Conditions for Estimating the Bioaccessibility of Mercury from Cinnabar Using an in vitro Digestion and Dialysis
       PANG Jingtuan, HU Guanglin* ,HAN Bin, QI Jiangning, LI Ping
       （Key Laboratory of Tropic Biological Resources of Chinese Educational Ministry, Hainan Provincial Key Laboratory of Fine Chemicals,Haikou 570228,China）
       Abstract：ObjectiveTo determine the simulated conditions for estimating the bioaccessibility of mercury from cinnabar by means of an in vitro digestion and dialysis.MethodsIn order to determine the appropriate simulated conditions, we simulated gastrointestinal digestion environment, and studied the effects of contact time,the pH of artificial gastric juice, addition of pepsin, dialysis time, addition of pancreatin bile salt mixture.ResultsThe simulated conditions were determined as follows: liquid/solid of 100, the pH value of 1.5 in artificial gastric juice, 1 ml pepsin which contained 0.16 g pepsin per ml, contact time of 100 min, 5 ml pancreatin bile salt mixture which contained 0.004 g pancreatin and 0.025 bile salt per ml,dialysis time of 100 min. We estimated the bioaccessibility of mercury from cinnabar by CV-AFS, and the mercury dissolution rate and bioaccessibility from cinnabar showed high repeatability, dissolution rate was about 2.5×10-6(n=6,RSD＝4.1％), and the bioaccessibility was about 4.8×10-7(n=6,RSD＝3.5％).ConclusionThe in vitro digestion and dialysis are suitable for estimating the bioaccessibility of mercury from Chinese traditional patent medicine which contains cinnabar.
       Key words：In vitro digestion and dialysis；  Cinnabar；  Bioaccessibility；  Mercury
       
       朱砂又名丹砂、辰砂等，始载于《神农本草经》，列为上品药，主含硫化汞(HgS)；其性微寒，有毒，归心经，有镇心安神、清热解毒之功，主治心神不宁、心悸消渴等病症［1］ 。近年来关于朱砂及含朱砂中成药对肾脏、中枢神经系统及生殖系统的毒性屡见报道［2］ 。目前，国际上对中药中重金属的毒副作用已相当重视，FDA和WHO均制定了类似食品、蔬菜以及茶叶等产品的重金属允许摄入量。美国、欧盟、日本等国家及我国传统中药出口的东南亚地区都制定了严格的重金属限量标准。但是，包括我国在内，所有针对汞制定的限量标准都只考虑了汞总量，这显然不能说明问题。对于以HgS为主要成分的矿物药朱砂，以汞总含量对其评价显然是片面的，因而如何合理评价朱砂及含朱砂中成药中汞的安全性已经成为一个亟待解决的问题，对朱砂中汞进行安全性评价就具有了重要的现实意义。
       
       体外消化透析法(in vitro Digestion and Dialysis)是通过模拟人体内消化环境，对营养物质被人体吸收利用部分进行评估的方法。此实验法有很多的优点，它较之动物实验更有说服力，和人体实验相比耗费小，简便易操作。近年来，科研人员在评价元素生物可接受率方面做了大量工作，体外消化透析法已经被广泛应用于测定食品中Fe，Ca，Zn［3，4］ 等营养元素和环境中Pb、Cd［4，5］ 等重金属元素的生物可接受率，并证实体外消化透析法测得的生物可接受率与人体吸收利用有较好的相关性。关于生物可接受率影响因素的报道很多，M. Waisberg［6］ 等报道了pH值和接触时间等对Cd元素生物利用性有显著影响。本实验研究了朱砂中汞溶出率和透析率的主要影响因素，分析实验结果并结合人体消化环境实际情况确定了体外消化透析法各主要影响因素的实验条件，建立了一种测定朱砂中汞生物可接受率的体外消化透析法实验流程，CV-AFS测定了朱砂中汞生物可接受率，并对朱砂安全性做了定性的说明。
       1    仪器与材料
       1.1   仪器 SYG-Ⅱ型智能冷原子荧光测汞仪（杭州大吉光电仪器有限公司）；MRG-70分装式高压密封消化罐（沈阳森华理化仪器研究所）；pHS-25型酸度计（上海伟业仪器厂）；THZ-82型水浴恒温振荡器（江苏天由有限公司）；101-OS型数显式电热恒温干燥箱（上海沪越实验仪器有限公司）；FA1004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂）。
       1.2  试剂  胃蛋白酶（上海国药集团化学试剂有限公司，BR）；胰蛋白酶（上海楷洋生物技术有限公司，BR)；猪胆盐（上海国药集团化学试剂有限公司，BR）；透析袋截留分子量（Molecular Weight Cut-off,MWCO）12000～14000 Da（上海双向西巴斯科技发展有限公司）；HNO3，HF，HCl，SnCl2为GR级试剂，KH2PO4，NaHCO3，NaOH为AR级试剂，水飞朱砂（按2005年《中国药典》的硫氰酸铵法测得HgS含量98.3％）；汞标准贮备液（100μg·ml-1国家环保总局标准样品研究所）；杨树叶标准物质（GBW 07603）由地矿部物化探研究所提供；实验用水为二次亚沸蒸馏水。
       2  方法
       2.1   溶液的制备
       2.1.1  人工胃液 二次亚沸蒸馏水稀释13 mol·L-1HCl至pH=1.50，待用。
       
       2.1.2  胃蛋白酶  取1.6 g胃蛋白酶溶于10 ml 0.1 mol·L-1 HCl，配制成质量浓度为0.16g·ml-1胃蛋白酶［7］ ，现配现用。
       
       配制1 mol·ml-1NaHCO3，6 mol·ml-1HCl，0.1 mol·ml-1NaOH， 0.1 mol·ml-1NH4SCN，2%FeSO4，1%KMnO4，0.2%NH4Fe(SO4)，6 mol·ml-1 NaOH等水溶液待用。
       2.1.3  人工肠液 取KH2PO46.8 g，加水500 ml溶解，用0.1 mol·L-1NaOH水溶液调节pH值至6.8。
       2.1.4  胰液胆盐混合物  0.180 g胰蛋白酶、1.125 g胆盐溶于45 ml人工肠液，配制成胰蛋白酶、胆盐质量浓度分别为0.004 g·ml-1和0.025 g·ml-1的胰液胆盐混合物［7］，现配现用。
       2.2   胃消化环境模拟实验 准确称取一定量朱砂加入人工胃液，搅拌呈匀浆状，加入胃蛋白酶，（37±1）℃，80 r·min-1条件下振荡，一定时间后，离心，取上清液。
       2.3   肠吸收环境模拟实验 将胃消化环境实验所得样品进行酸度滴定，确定所需要NaHCO3量。将实验中确定NaHCO3水溶液量加入到透析袋中，置透析袋于胃消化实验所得样品中，（37±1）℃，80 r·min-1条件下振荡，pH值达到5.0后［9］，向样品中加入胰蛋白酶胆盐混合物，继续振荡，开始计时，一定时间后，收集透析液。
       2.4  汞的测定方法 所得样品均用高压密封消解-CV-AFS测定汞含量［8］。
       2.5  数据处理 测定朱砂溶出汞量以及透析汞量，参照文献中计算Zn，Fe元素生物可接受率的方法［9］，生物可接受率可由肠消化环境下测得的透析率表示。朱砂中汞溶出率以及生物可接受率公式如下：
       
       a=BA×100%      b=CA×100%
       
       公式中a、b 分别表示朱砂中汞的溶出率和生物可接受率，A、B、C分别表示朱砂中汞在朱砂中总汞量、胃模拟阶段朱砂中溶出量、朱砂中汞在肠模拟阶段透析量。
       3  结果与讨论
       3.1  胃消化环境模拟条件确定 体外消化透析法在模拟胃消化阶段主要考虑影响因素有液/固比、pH值、加入酶量、接触时间。本文为提出朱砂中汞安全性评价实验方法，在实验条件的选择中，我们在保证与人体环境尽可能接近的同时选择汞溶出率最高的实验条件。
       
       在研究液/固比对朱砂中汞溶出率影响的实验中，本实验分别选用液/固比为100，200，300，400，500，600，800，1 000，测定不同液/固比下朱砂中汞溶出率［10］。以液/固比为横坐标，朱砂中汞溶出率为纵坐标，见图1。实验结果显示，液/固比在100～1 000范围内汞溶出率为（2501±91）ng·g-1，P＞0.05，影响不显著，实验中液/固比选择为100。
       
       在研究pH对汞溶出率的影响实验中，考虑到人体胃消化环境pH值变化范围为1～5［11］，实验中用6 mol·L-1 NaOH和6 mol·L-1 HCl水溶液调节待加入人工胃液的pH为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，测定不同pH值下汞溶出率。以pH值为横坐标，朱砂中汞溶出率为纵坐标，见图2，实验结果发现：pH值对朱砂中汞溶出率有很显著的影响，变化趋势与文献报道类似［7］，不同的是文献报道pH>2.0时溶出率变化不大，低于2.0时变化明显，我们发现pH>2.5时，随pH增大溶出率变化不大，pH<2.5时，随pH降低朱砂中汞溶出率显著增大。空腹时人体最低pH<2.0。参考相关文献［11］，结合实验结果，实验中加入的人工胃液pH=1.5。
       
       朱砂中汞溶出率可能还会受到胃蛋白酶量的影响，实验中分别加入0.16 g·ml-1胃蛋白酶0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 ml。以加入胃蛋白酶量为横坐标，朱砂中汞溶出率为纵坐标，见图3。在改变加入胃蛋白酶量实验中发现：未加入胃蛋白酶时，朱砂中汞溶出较少，加入蛋白酶后，朱砂中汞溶出率显著增大。加入胃蛋白酶量在1～3.5 ml时，朱砂中汞溶出率为（2553±93）ng·g-1，P>0.05，无显著影响，与曾克武［12］报道加入蛋白酶量影响朱砂中汞溶出率不显著相似。因此，实验中加入0.16 g·ml-1胃蛋白酶1 ml。
       
       在研究接触时间对朱砂中汞溶出实验中，我们分别测定了15，30，45，60，75，90，105，120 min朱砂中汞溶出率。以时间为横坐标，朱砂中汞溶出率为纵坐标，见图4。实验结果表明，朱砂中汞溶出率在0～60 min阶段缓慢增大，在60～75 min阶段很快增大，在75～90 min缓慢增大，90～120 min基本不再变化，溶出趋于平衡。对于朱砂的体外消化模拟研究，在保证溶出达到平衡条件下，应尽量减少接触时间。根据实验结果，我们选100 min作为胃消化模拟的接触时间。
       图1  液/固比对朱砂中汞溶出率的影响  （略）        
       图2  人工胃液pH对朱砂中汞溶出率的影响（略）
        
       图3  胃蛋白酶量对朱砂汞的溶出率的影响 （略）        
       图4  接触时间对朱砂中汞溶出率的影响 （略）
          
       3.2  肠吸收环境模拟条件确定 体外消化透析法是通过透析袋模拟元素的被动扩散来完成肠吸收模拟实验，本阶段实验中要考虑的透析率影响因素有：透析袋的MWCO，加入胰液胆盐混合物量，透析时间。
       
       被动扩散是朱砂中汞在透析液和模拟环境之间运输的唯一方式，本文用透析实验模拟朱砂中溶出汞在小肠内的被动扩散，采用MWCO为12 000～14 000 Da透析袋进行透析实验。首先对经胃模拟处理样品进行酸度滴定，将酸度滴定确定中和所需要NaHCO3水溶液量加入到透析袋中，然后置透析袋于经胃消化环境模拟处理过的样品中，监测肠模拟吸收环境中pH值的变化，结果发现在（30±2）min，pH可达到5.0，与人体此阶段pH变化相似［7］。实验表明MWCO为12 000～14 000 Da透析袋在本实验中可用于本文中的透析模拟实验。
       
       在研究加入胰液胆盐混合物量对透析率影响的实验中，调节pH达到5.0后，分别加入0，1.5，3.0，5.0，7.0，9.0 ml胰液胆盐混合物，以加入胰液胆盐混合物量为横坐标，朱砂中汞透析率为纵坐标（见图5）。实验结果发现，加入胰液胆盐混合物后，朱砂中汞透析率有显著减小；加入胰液胆盐混合物量在3.0～9.0 ml时，朱砂中汞透析率为（530±8）ng·g-1，P>0.05无显著影响。根据实验结果，本实验可确定加入胰液胆盐混合物量为5 ml。
       
       在研究时间对透析率实验中，我们测定透析时间分别为15，30，45，60，75，90，105，120 min时朱砂中汞透析率。以透析时间为横坐标，汞透析率为纵坐标，见图６。实验结果表明：0～90 min透析率逐渐变大， 90～120 min，朱砂中汞透析率基本趋于平衡。根据实验确定100 min为肠吸收环境的透析时间。
       图5  胰液胆盐量对朱砂中汞透析率的影响  （略）        
       图6  透析时间对朱砂中汞透析率的影响（略）
         
       3.3  体外消化透析法实验流程 根据实验确定的各个参数，参考中国台湾卫署食字第0950405557号公告附件［13］，建立体外消化透析法流程图，见图7。
       图7  体外消化透析法测朱砂中汞的生物可接受率实验流程（略）
       3.4  测定朱砂中汞的生物可接受率 按确定实验流程处理朱砂样品，实验步骤如下：称取0.50 g朱砂，加入到100 ml烧杯中，向烧杯中加入50 ml pH=1.50的人工胃液，摇匀，加入“2.1.2”项配制的胃蛋白酶1 ml，37±1℃，80 r·min-1水浴恒温振荡器消化100 min，CV-AFS测定汞溶出量，将胃模拟处理过的样品进行酸度滴定，求得中和需要1.9 ml 1 mol·L-1NaHCO3水溶液。将盛有1.9 ml 1 mol·L-1NaHCO3水溶液的透析袋放入到胃消化物中，（37±1）℃，80 r·min-1水浴恒温振荡器消化反应30 min，pH可达到5.0，加入“2.1.4”项中配制的胰液胆盐混合物5 ml，再透析100 min，收集透析液，CV-AFS测定汞含量［10］，根据“2.1.4”项中公式求得在胃模拟环境朱砂中汞溶出率为2.5×10-6（n=6，RSD=4.1%）；朱砂中汞的生物可接受率为4.8×10-7(n=6，RSD=3.5%)，数据显示比较好的重现性。实验结果表明，朱砂中汞溶出远大于按其溶度积（其中α-HgS，logKsp=-54）计算的理论值，表明朱砂中汞的生物可接受率受到模拟消化环境中很多因素的促进。但是，本实验所用水飞朱砂中汞溶出率非常低，同时，其生物可接受率也很低，汞潜在健康风险低。本实验流程可用于含朱砂中成药复方芦荟胶囊等中汞的生物可接受率测定及相关研究，这方面工作我们将另文报道。
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