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       【摘要】 
       目的通过观察益气回阳注射液对心脏骤停大鼠心肺复苏（CPR）后血清中丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）的影响及血白细胞、心肌细胞中细胞黏附分子－1(ICAM-1)表达的影响，探讨益气回阳注射液在CPR后缺血再损伤防治中的可能分子机制。方法将50只清洁级雄性Wistar大鼠采用SAS 6.12数字随机分为5组：益气回阳组、益气回阳＋肾上腺素组（简称中西药合用组）、肾上腺素组、模型组、正常对照组，每组10只。采用夹闭气管窒息法制作心脏骤停大鼠模型，在自主循环恢复30min后处死动物，应用流式细胞技术，测定血清中MDA、SOD及血白细胞、心肌组织中ICAM-1的表达。结果模型组大鼠血清MDA含量较正常对照组明显升高（P<0.01），益气回阳组、肾上腺组、中西药合用组血清MDA的含量较模型组显著下降(P<0．01)，中西药合用组与益气回阳组和肾上腺组比较差异有显著性（P<0.05）；模型组大鼠血清SOD含量较正常对照组明显降低(P<0.01)，益气回阳组、肾上腺素组、中西药合用组SOD含量较模型组显著升高(P<0.01)；中西药合用组与益气回阳组和肾上腺素组比较差异有显著性(P<0.05)；大鼠模型组血白细胞及心肌ICAM-1的表达较正常对照组升高（P<0.05），而益气回阳组、肾上腺素组、益气回阳＋肾上腺素组ICAM-1的表达较模型组显著下降（P<0.01），三者组间比较无显著差异（P>0.05）。结论益气回阳注射液能减少心脏骤停后血清中MDA的生成，增加SOD活性，对心肺复苏后再灌注损伤有一定的治疗作用；益气回阳注射液可能通过抑制血白细胞及心肌ICAM-1表达，在一定程度上减轻复苏引起的心肌细胞的损伤。
       【关键词】  益气回阳注射液； 心脏骤停； 心肺复苏超氧化物岐化酶； 丙二醛； 心肺复苏； 细胞黏附分子－1
       Interference Effects of Yiqihuiyang Injection on Model of Cardiac Arrest
       ZHOU Wenbin,YIN Kechun,LIU Shujuan,CHEN Li
       (Third Section of Heart Center,Second Clinical Medical College,Guangzhou University of Chinese　Medicine,Guangzhou,510120,China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of Yiqihuiyang injection on the levels of MDA and SOD in rats after cardiopulmonary resuscitation(CPR) cardiac arrest rats, and its possible molecular mechanism.Methods50 clean male rats were randomly divided into five groups, Yiqihuiyang group, combined Chinese and western medicine group, epinephrin group, model group, and normal control group,with 10 rats in each group respectively. The rats were executed and the hearts were isolated 30 min after the recovery of sutonomic circulation.The levels of blood MDA,SOD were measured in each group and the protein expression of ICAM-1 was determined by flow cytometry.ResultsThe content of MDA in model group was significantly higher than that in control group(P＜0.01),and the activity of SOD in model group was significantly lower than that in control group(P＜0.01).The concentrations of MDA in epinephrin group, combined Chinese and western medicine group were significantly lower than that in control group,and the activity of SOD in these groups were significantly higher than that in control group(P＜0.01).In the three groups the combined chinese and western medicine group had more significant influence on the blood Levels of MDA and SOD.On the other hand,the expression of ICAM-1 of the model group was different from the control group(P＜0.05).The expression of ICAM-1 was inhibited in epinephrin group, Yiqihuiyang group and combined Chinese and western medicine group(P＜0.05). The three groups had no significant difference(between them P＜0.05).ConclusionYiqihuiyang injection may attenuate reperfusion injury after CPR through reducing MDA and increasing SOD activity.At the same time,Yiqihuiyang injection has an effect in reducing the myocardial injury induced by resuscitation by blocking the expression of ICAM-1.
       Key words：Yiqihuiyang injection;  Cardiac arrest;  Cariopulmonary resuscitation;  Superoxide dismutase(SOD);  Malondialdehyde(MDA);  Intercellular adhesion molecular-1
       
       心脏骤停(Cardiac Arrest，CA)是目前临床上的危急重症。快速、有效的心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation，CPR)是心脏骤停抢救成功的关键。心脏骤停后(即全身自主循环停止后)，机体包括心、脑、肾等重要脏器普遍发生缺血、缺氧，处于一个严重的全身缺血、缺氧状态；随着快速、有效的心肺复苏，自主循环恢复后，全身脏器得以重新灌注血液，在这一缺血、缺氧、再灌注过程中，心、脑、肾等重要脏器发生一系列病理生理变化，其功能也随之发生改变，即随着机体自主循环的建立就会出现再灌注损伤，而心肺复苏的过程就相当于缺血再灌注的过程［1］。由于缺血再灌注损伤，内脏器官出现继发性损害，内脏器官所受缺血再灌注损伤程度影响着心肺复苏患者的预后［2］，因此减轻再灌注损伤在CPR中的重要意义不言而喻。
       
       既往研究证实，缺血缺氧的器官组织再灌注后氧自由基的大量生成是造成继发损伤的主要机制之一，组织中丙二醛（MDA）和超氧化物岐化酶（SOD）的含量可作为评定氧自由基生成和对生物膜结构破坏的指标［3］。近年来，随着对CPR研究的深入，中性粒细胞和血管内皮细胞的黏附、白细胞的聚集在缺血再灌注损伤发生中的重要性被逐渐认识，特别是黏附分子的研究受到研究者广泛重视，其中细胞间黏附分子-1（ICAM-1）被认为在缺血再灌注损伤过程中起着重要的作用。但ICAM-1在心脏骤停的临床和实验研究中所见较少，国内外尚未见有中药对心脏骤停心肺复苏后心肌细胞细胞黏附分子（ICAM-1）表达干预作用的研究。因此，在心脏骤停实施CPR期间如何保护心肌组织、减轻心肌缺血再灌注损伤从而提高复苏成功后自主循环的稳定性，是CPR研究领域中的一个重要课题；有相关研究证明［4，5］，中成药参附类药物对心肌再灌注损伤有一定的干预作用，临床配合常规心肺复苏，可以提高CPR的成功率。
       
       本实验研究通过观察益气回阳注射液对心脏骤停大鼠心肺复苏后血丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）含量的变化的影响，通过观察益气回阳注射液对心脏骤停大鼠心肺复苏后血白细胞及心肌细胞ICAM-1表达的影响，探讨益气回阳注射液在CPR后缺血再损伤防治中的可能分子机制。
       1  器材与方法
       1.1  药物、试剂与仪器肾上腺素由广州明兴制药厂生产，批号MC3201；益气回阳注射液为广东省中医院制剂，批号04020301；抗大鼠ICAM-1单抗为法国Immunotech公司产品，购自深圳晶美生物工程有限公司；微型呼吸机购自深圳瑞沃德科技有限公司，型号SAR-830；流式细胞仪coulter ESP公司，U.S.A。
       1.2  动物与分组选择体重300～400 g清洁级雄性SD大鼠50只（广州中医药大学动物实验中心提供，合格证号2003A010），采用SAS 6.12数字随机分为5组：益气回阳组、益气回阳＋肾上腺素组（简称中西药合用组）、肾上腺素组、模型组、正常对照组。
       1.3  模型复制与复苏采用窒息方法制作大鼠心脏骤停动物模型：30 g/L戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔内注射麻醉，气管插管，心电监护，在动物呼吸末夹闭气管3～4min，心脏完全停搏，心电图QRS波随之完全消失，心脏搏动停止，或出现持续性室颤，造模成功。
       
       造模成功后立即开始复苏，接微型呼吸机以纯氧进行机械通气（通气频率80 次/min，潮气量6 ml/kg），同时进行人工胸外心脏按压，按压频率160 次/min，按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3。并根据不同分组给予不同药物从股静脉内注射，每5 min 1次，直至复苏成功，或复苏时间达到30 min为止。益气回阳组予益气回阳注射液2 mg/kg；中西药合用组予益气回阳注射液2 mg/kg和肾上腺素0.02 mg/kg联合使用；肾上腺素组予肾上腺素0.02 mg/kg；模型组只复苏不用药。除正常对照组外，以上4组动物均行麻醉、气管切开、插管，建立股静脉通路。
       1.4  标本的采集根据心电变化和心脏搏动，判断心脏骤停时间及自主循环的恢复，自主循环恢复后停止胸外按压，继续机械通气0.5 h，从股静脉取抗凝血，在自主循环恢复180 min后处死动物，摘取心脏。
       1.4.1  血清MDA，SOD浓度测定MDA检测用巴比妥酸比色法，SOD检测用黄嘌呤氧化法，以每毫克蛋白血硝酸盐含量为单位，NU/mg。
       1.4.2  ICAM-1的表达测定取抗凝血200 μl，用抗大鼠ICAM－1单抗20 μl标记15 min后，在流式细胞仪上检测白细胞ICAM－1的表达量，以μg/L来表示。取大鼠心肌组织1～2 cm3，用消化液（EDTA－胰酶）消化、分离心肌组织至单细胞悬液，再用PBS洗涤，1 000 r/min离心，弃上清，调整细胞浓度至1×106个/10 μl；用抗大鼠ICAM－1单抗20 μl标记15 min后，在流式细胞仪上检测心肌细胞ICAM－1的表达量，以μg/L来表示。
       1.5  统计学方法所有数据均在SPSS 11.0软件上建立数据库并进行统计分析。组间计量资料比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用一般线性模型分析(析因设计)，检验水准α＝0.05，双侧检验。
       2  结果
       2.1  益气回阳注射液对大鼠血清MDA，SOD的影响
       2.1.1  益气回阳注射液对大鼠血清MDA的影响见表1。模型组大鼠血清MDA含量较正常对照组明显升高（P<0.01）；益气回阳组、肾上腺组、中西药合用组MDA的含量较模型组显著下降(P<0．01)。中西药合用组与益气回阳组和肾上腺组比较差异有显著性（P<0.05）。
       2.1.2  益气回阳注射液对大鼠血清SOD的影响见表1。模型组大鼠血清SOD含量较正常对照组明显降低(P<0.01)；益气回阳组、肾上腺素组、中西药合用组SOD含量较模型组显著升高(P<0.01)；中西药合用组与益气回阳组和肾上腺素组比较差异有显著性(P<0.05)。
       表1  各组血清MDA及SOD含量的比较（略）
       与正常对照组比较，△P<0.01；与模型组比较，*P<0.01；与益气回阳组、肾上腺素组比较，#P<0.05；n=10
       2.2  益气回阳注射液对大鼠血白细胞及心肌细胞ICAM-1表达的影响
       2.2.1  益气回阳注射液对大鼠血白细胞ICAM-1表达的影响（见表2）。在缺血再灌注后30 min实验动物的血白细胞ICAM-1即开始升高，大鼠模型组ICAM-1的表达较正常对照组升高（P<0.05），而益气回阳组、肾上腺素组、益气回阳＋肾上腺素组ICAM-1的表达较模型组显著下降（P<0.01），三组间比较无显著差异（P>0.05）。
       2.2.2  益气回阳注射液对大鼠心肌细胞ICAM-1表达的影响见表2。在缺血再灌注后30min实验动物的心肌组织ICAM-1即开始升高，大鼠模型组ICAM-1的表达较正常对照组明显升高（P<0.05），而益气回阳组、肾上腺素组、益气回阳＋肾上腺素组ICAM-1的表达较模型组显著下降（P<0.01），三组间比较无显著差异（P>0.05）。
       表2  各组血白细胞及心肌细胞ICAM-1表达的比较（略）
       与正常对照组比较，△*P<0.05；与模型组比较，*P<0.01；三组间比较，#P＞0.05；n=10
       3  讨论
          
       本研究结果表明，益气回阳注射液能减轻心脏骤停后血中MDA的生成，增加SOD活性，对心肺复苏后再灌注损伤有一定的治疗作用；益气回阳注射液可能通过抑制血白细胞及心肌ICAM-1表达，在一定程度上减轻复苏引起的心肌细胞的损伤。
       
       心脏骤停是临床最紧急、最危重的突发情况，心肺复苏则是针对心跳骤停的抢救措施，但成功率很低。据报道，能迅速恢复自主循环的仅有14％～30％，长期存活更低于10％［6］。心脏骤停CPR后死亡者中心功能不全占1/3以上。目前认为全心缺血－再灌注损伤是导致复苏后心肌收缩和舒张功能不全的主要因素［3,7］。
       
       益气回阳注射液(广东省中医院制剂)是由人参、附子、黄芪组成。现代药理研究证明［8］，人参可以兴奋心肌、增加心脏收缩力，有与强心苷极为相似的强心作用，同时有改善微循环、扩张血管、提高机体适应性，达到升压、稳压的作用；而附子中的消旋去甲乌头碱是重要的强心成分，同时有对血压的双向调节作用，两药合用对循环系统有显著的增强效应，有较好的强心、升压、稳压、改善微循环、扩张冠脉、减轻心肌缺血损伤、调节心律的作用。
       
       心脏骤停后机体处于一个严重的全身的缺血、缺氧状态，随着自主循环的建立就会出现再灌注损伤，其中氧自由基是心肌再灌注损伤的一个重要原因：心肌缺血再灌注后几秒至几分钟内，血液和心肌组织内的氧自由基含量可增加数倍，自由基的产生主要通过黄嘌呤氧化酶的激活、中性粒细胞的活性爆发、儿茶酚胺的自身氧化等途径，通过与生物膜磷脂中的多价不饱和脂肪酸作用，形成一系列脂质过氧化物，导致脂质过氧化损伤，并生成大量的丙二醛（MDA）破坏组织蛋白，使细胞进一步遭到损害，从而影响细胞的收缩功能，导致心功能不全。而SOD在体内自由基清除系统起关键作用，不断清除超氧阴离子（O-2·）及H2O2所引起的歧化反应，可保护细胞免受自由基的损伤，是体内主要的抗氧化酶。因此，组织中MDA和SOD的含量可作为评定氧自由基生成多少和对生物膜结构破坏严重程度指标［3］，而心肌局部及血液中MDA和SOD的含量可间接反映出心脏骤停后心肌缺血再灌注后氧自由基损害的程度及内源性抗氧化机制的削弱。
       
       本实验中模型组MDA浓度明显高于正常对照组，SOD含量较对照组明显降低，经益气回阳注射液治疗后，MDA浓度较对照组明显降低，SOD含量较对照组升高。上述结果显示，在CPR后，由于心肌经历缺血再灌注损伤后，机体产生并释放出大量的氧自由基，氧自由基损害过程的持续，导致MDA大量生成，同时由于机体原有SOD的过度消耗，使之水平下降；而益气回阳注射液通过抑制氧自由基的损伤和脂质过氧化反应，减少MDA的生成，实验组SOD活力的上升也提示氧自由基的生成和释放减少。本实验研究发现经益气回阳注射液干预后可减少MDA的生成，并可使心肌SOD的降低有所减轻，表明益气回阳注射液可能有增强内源性氧自由基清除系统的功能，从而减轻了氧自由基对细胞膜脂质的过氧化作用，保护细胞膜及整个细胞；从而减轻心肌的缺血再灌注损伤，提示对心肺复苏治疗有一定的价值。
       
       另外，缺血再灌注除了促进氧自由基活化、释放，还激活中性粒细胞与冠脉血管内皮大量表达黏附分子，而使中性粒细胞在血管内皮表面粘附、聚集，进而启动一系列损伤［9］。目前，中性粒细胞黏附、白细胞的聚集在缺血再灌注损伤的作用已为人们所认识，在许多研究中，粘附分子的研究受到重视。ICAM-1属于免疫球蛋白家族，广泛分布于内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞表面，其配体为整合素家族的CDlla／CD18，CDllb／CD18。其主要在白细胞上表达，两者结合后，可增强白细胞与白细胞、白细胞与内皮细胞之间的黏附。目前认为缺血再灌注激活了内皮细胞，上调编码在血管腔表面表达的黏附分子基因。中性粒细胞和内皮细胞的结合是组织损伤的前提，两者之间的相互作用通过各自表达的粘附分子ICAM-1，VCAM-1在内皮细胞表达，使中性粒细胞和内皮细胞紧密结合，随后进入缺血再灌注的组织中，引起组织损伤。中性粒细胞（PMN）激活通过释放肿瘤坏死因子、白细胞介素，而使ICAM-1的表达显著上升；血小板的激活会产生大量细胞因子促进ICAM-1表达上升。因而缺血再灌注后ICAM-1的表达会明显增高［10］。ICAM-1的表达增高导致PMN浸润增加，心肌组织细胞损伤加剧［11］。
       
       本实验结果显示，在缺血再灌注后30min实验动物的血、心肌组织ICAM-1即开始升高，模型组ICAM-1的表达与正常对照组比较有差异（P<0.05）；肾上腺素组、益气回阳组以及肾上腺素+益气回阳组血、心肌组织ICAM-1的表达受抑制，与模型组比较均有统计学差异（P<0.05）。以上说明益气回阳注射液可能通过抑制血白细胞及心肌ICAM-1表达，在一定程度上减轻缺血再灌注引起的白细胞聚集引发的炎症反应，避免心肌细胞的过度损伤。本研究中，益气回阳注射液与肾上腺素都可以抑制心肌细胞ICAM-1，但与肾上腺素合用未发现存在疗效增强作用，可能与本动物实验采用样本较少有关，仍待进一步相关实验及临床研究证实。
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