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       【摘要】 
       目的建立茴香的随机扩增多态DNA（RAPD）最佳反应体系。方法正交设计及方差分析应用于建立RAPD反应体系的研究。结果茴香的RAPD最佳反应体系为25 μl的反应体系中，含10×Buffer 2.5 μl，2.0 m MdNTPs 3.0 μl，2.0 U/μl Taq酶1.0 μl，2.0 μmol/L随机引物4.0 μl，30.0 ng/μl模板DNA30 ng，ddH2O 13.5 μl。结论正交设计及方差分析适用于茴香RAPD反应体系的建立。
       【关键词】  茴香； 正交设计； 随机扩增多态DNA； 反应体系； 方差分析
       Study on Optimization of the RAPD System of Fennel by Orthogonal Design
       LI Haibo，WANG Yumei*，HE Jinming
       （Shaoguan University，Shaoguan，Guangdong 512005，China）
       Abstract：ObjectiveTo establish optimal RAPD reaction system of Fennel.MethodsThe orthogonal design and variance analysis were used to optimize the RAPD system.ResultsThe optimal Fennel RAPD system was composed of 2.5 μl 10×PCR Buffer,3.0 μl  dNTPs(2.0 mmol/L),1.0 μl  TaqE(2.0 U/μl ),4.0μl Primer(2.0 μmol/L),1.0 μl DNA(30.0 ng/μl ),13.5 μl  ddH2O with total 25 μl  reaction system.ConclusionThe orthogonal design and variance analysis can be used to optimize the RAPD system.
       Key words：Fennel;   Orthogonal design;   RAPD;   Reaction system;   Variance analysis
       
       茴香Foeniculum vulgare Mil1.为伞形科茴香属多年生宿根草本植物，原产地中海沿岸及西亚，在我国北方各地被广泛栽培。
       
       茴香的茎、叶、种子都含有挥发油，其主要成分为茴香醚及茴香酮，具有特殊的香味。我国北方主要把茴香作调味品或馅食。其果实可作香料及药用，有温肝肾、暖胃气、散寒结的作用［1］。
       
       随机扩增多态DNA(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)标记是由Williams 等和Welsh等在PCR技术基础上发展起来的一种分子标记，广泛应用于遗传多样性分析、物种进化、品种鉴定、分类等研究领域。为了更好地利用RAPD技术对茴香进行聚类分析，确定品种间亲缘关系，进而为茴香育种提供理论指导，本研究以内蒙古茴香DNA为材料，采用正交设计构建扩增方案，并对实验结果进行方差分析，对各因素水平间进行了SSR法多重比较，最终建立了适合于茴香的RAPD最佳反应体系，以期为进一步的RAPD研究打下坚实的基础。
       1   材料与方法
       1.1   DNA的提取以SDS法提取内蒙古茴香总DNA，以1.0 ％(W／V)琼脂糖凝胶电泳检测所得DNA质量，并用UV3000型紫外分光光度计检测DNA浓度，ddH2O稀释至30.0 ng/μl。
       1.2   正交设计方法选用L25（56）正交表（见表1）。共设计25个处理，反应总体积为25 μl，每个反应体系均含10×PCR Buffer（含20 mmol/L Mg2+）2.5 μl，其余组分［Taq DNA聚合酶、dNTPs（北京鼎国生物技术有限责任公司提供）；引物（北京奥科生物技术有限责任公司提供）；DNA］按表1稀释并添加，再用ddH2O将体系补至25.0 μl。
       表1  RAPD反应体系的正交设计及扩增结果（略）
       1.3   PCR扩增与产物检测在FTH-04AB-102型PCR仪（杭州大和热磁电子有限公司）上进行扩增，热循环参数为95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，45℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
       
       扩增产物在1.0 ％(W／V)琼脂糖凝胶中电泳，以λDNA（EcroI+HindⅢ）（北京鼎国生物技术有限责任公司提供）为Marker，经EB染色。在hnageMaster VDS凝胶成像系统上成像检测，照相并存盘。
       1.4   数据分析统计每个处理扩增后DNA片段数目，并参照Marker电泳片段的亮度对处理所得片段亮度进行打分，打分标准为：片段亮度大于等于21 228 bp片段，分值为5分；片段亮度介于5 146～3 530 bp片段之间，分值为4分；片段亮度介于2 027～1 904 bp片段之间，分值为3分；片段亮度介于1 584～1 375 bp片段之间，分值为2分；片段亮度低于1 375 bp片段，分值为1分。平均片段亮度＝某处理片段亮度得分总和/某处理片段总数。
       
       对所得片段数目及亮度两个结果分别进行方差分析及SSR法各因素水平间多重比较，获得较好的反应体系。
       1.5   最佳反应体系的验证为验证最佳反应体系的稳定性，采用多个引物对多个茴香材料进行RAPD扩增，观察其重复性及稳定性。
       2  结果
       2.1   正交设计的处理结果及分析选用引物P41（GTTTCGCTCC）按表1设计对内蒙古茴香进行RAPD扩增（见图1，表1）。分别对表1扩增片段数量及扩增片段亮度进行方差分析。结果见表～3。
       2.1.1   扩增片段数量从表2可知，MSe1/MSe2＝1.26≤F0.05（8，24）＝2.36，说明实验因素之间差异不显著，即实验因素之间无交互作用。故将模型误差MSe1与试验误差MSe2合并，得MSe＝（SSe1＋SSe2）/（dfe1＋dfe2）＝1.84，进行方差分析。F检验结果表明，dNTPs（A）、随机引物（C）因素对扩增片段数量有极显著影响，而Taq酶（B）、模板DNA（D）因素对扩增片段数量影响不显著，区组间差异不显著。模型误差MSe1不显著，说明试验因素间交互作用不显著，经SSR法多重比较表明，A因素第2至第5水平均与第1水平平均扩增片段数间差异极显著，第2至第5水平之间差异不显著；B因素第4水平与第1水平之间平均扩增片段数间差异显著，其余各水平间差异不显著；C因素第4，5水平结果相同，均与第1，2水平间差异极显著，与第3水平间差异不显著；D因素第1水平与其余4个水平间差异显著或极显著。综上所述，各因素的最优水平为A2至A5，B2至B5，C4或C5，D1。
       图1  反应体系的正交设计扩增结果（略）
       2.1.2   扩增片段亮度扩增片段亮度的方差分析结果与扩增片段数量方差分析结果相似（见表3），MSe1/MSe2＝1.39≤F0.05（8，24）＝2.36，说明试验因素之间差异不显著，即试验因素之间无交互作用。故将模型误差MSe1与试验误差MSe2合并，得MSe＝（SSe1＋SSe2）/（dfe1＋dfe2）＝25.30，进行方差分析。F检验结果同样表明，dNTPs（A）、随机引物（C）因素对扩增片段亮度有极显著影响，而Taq酶（B）、模板DNA（D）因素对扩增片段亮度影响不显著，区组间差异不显著。经SSR法多重比较结果同样表明，A因素第3与第1，2，4水平差异极显著、与第5水平差异不显著，第5水平与第4水平差异不显著；B因素第2水平与第1水平之间差异极显著，与其余各水平间差异不显著；C因素第4，5水平与第1，2水平间差异极显著，与第3水平间差异不显著；D因素第1水平与第3，4，5水平间差异极显著。各因素扩增片段亮度的最优水平与扩增片段数量的最优水平相同，为A3，B2至B5，C4或C5，D1。
       表2  扩增片段数量方差分析（略）
       表3  扩增片段亮度方差分析（略）
       2.1.3   最佳体系的初步确定综合影响扩增片段数量及扩增片段亮度因素最优水平组合，初步确定A、D因素的最优水平为A3，D1，为降低试验成本，B、C因素的最优水平为B2、C4，故该试验最优水平组合为A3B2C4D1。对应于表1反应处理，该最优水平组合为处理12。从图1也可得出，处理7，9，12，13，20，24所得片段平均数量为6～7条，差异不显著；处理12，24，25所得片段平均亮度在3.4～3.7之间，差异不显著。综合考虑所得片段数量及亮度的条件下，处理12，24可以作为最佳组合，即该两个处理体系RAPD扩增结果所得片段数量多、亮度高。但从两个处理体系组成来看，处理24含dNTPs 5.0 μl，Taq酶2.0 μl，引物3.0 μl，DNA 2.0 μl，处理12则含dNTPs 3.0 μl，Taq酶1.0 μl，引物4.0 μl，DNA 1.0 μl，考虑两者的实验成本，处理12的实验成本远远低于处理24，故将处理12作为最佳处理。即在本实验中，最佳处理与最优水平组合相吻合，在25 μl的反应体系中，含10×Buffer 2.5 μl，dNTPs 3.0 μl，Taq酶1.0 μl，随机引物4.0 μl，模板DNA 1.0 μl，ddH2O 13.5 μl。
       2.1.4   最佳体系的验证为验证上述最优水平组合处理的稳定性，应用引物P65（CCAGATGGGG ）、P49（GTAAGCCCCT）分别对6种茴香品种进行RAPD扩增。结果如图2。两个引物对每份茴香DNA均能扩增出丰富清晰可辨的扩增片段，而且重复性良好，说明该反应体系稳定性强，适合茴香RAPD扩增。
       图2  最佳反应体系的验证（略）
       3  讨论
       3.1   正交设计方差分析在RAPD反应体系构建中的应用应用正交设计构建最佳反应体系的研究已有较多报道［2～4］，但对于扩增结果进行量化分析却鲜见报道。本文在采用正交设计对茴香RAPD反应体系进行优化的基础上，对扩增结果进行方差分析及SSR多重比较。研究结果表明，正交设计不仅可以应用于RAPD反应体系的构建，同时应用数据分析确定RAPD最佳反应体系具有实际应用价值。
       3.2   关于最优水平组合与最佳处理的验证本实验采用了SSR法对参试因素进行了多重比较，得到了最优水平组合。同时，根据正交设计表1建立了25个反应体系，扩增出25个实验结果，从中得到了最佳处理。经比较，本实验中最佳处理与最优水平组合恰巧相同，故不再进行进一步筛选。如果实验中最优水平组合与最佳处理结果不同，则需设计实验对二者进行进一步的筛选。
       3.3   RAPD各组分对扩增效果的影响从方差分析结果可知，在RAPD扩增过程中，各实验因素对扩增结果无交互作用，而在参与研究的4个因素中，dNTPs及引物对实验结果表现极显著作用，Taq酶及模板DNA则均作用不显著。说明在本实验设计的范围之内，dNTPs及引物用量对实验结果影响较大，而Taq酶及模板DNA用量对实验结果影响较小。另外，本实验使用的PCR Buffer为含Mg2+（20 mM）Buffer，故对影响RAPD扩增的另一重要因素Mg2＋未加讨论。经过研究，初步确定茴香的RAPD最佳反应体系为25.0 μl的反应体系中，含1×Buffer 2.5 μl，dNTPs 3.0 μl，Taq酶1.0 μl，随机引物4.0 μl，模板DNA 1.0 μl，ddH2O 13.5 μl，可以应用于大量分析。
       【参考文献】
         ［1］ 宋元林，张君亭，陈永辉．稀特蔬菜高效栽培，第二版［M］．北京：中国农业出版社，2001：250．
       
       ［2］ 侯大斌，范理章，邓国涛,等．正交设计在梨基因组RAPD优化体系中的应用［J］．乐山师范学院学报，2006，21（12）：54．
       
       ［3］ 王家保，刘志媛，徐碧玉,等．用正交设计优化荔枝RAPD反应体系［J］．武汉植物学研究，2005，23（4）：363．
       
       ［4］ 滕兆岩，王艳丽，石小燕,等．星星草RAPD-PCR反应体系建立与优化［J］．生物技术，2007，17（1）：48．