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       【关键词】  色谱
        摘要：目的：建立高效液相色谱法测定三叶木通中齐墩果酸的含量。方法：采用Hypersil ODS柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相A：水，B：甲醇，梯度洗脱0 min:AB(25∶75)，10 min；AB(10∶90)，20 min：AB(5∶95)，检测波长：215 nm，流速：0.8 ml・min1，柱温：20℃。结果：齐墩果酸获得良好分离，在1.22～6.10 μg线性关系良好(r=0.999 9)平均加样回收率为98.8%。结论：该方法精密度高，重现性好，可用来对三叶木通进行质量控制。
        关键词：三叶木通；齐墩果酸；高效液相色谱法
        Determination of Oleanolic Acid in Akebia trifoliate by HPLC
        LIU Weiguo, YANG Wenyu*, WANG Xiaohui, LIU Hongchang
        (Sichuan Agricultural University,Yaan 625014, China)
        Abstract:Objective:To establish an HPLC method to determine the content of oleanolic acid in Akebia trifoliate.Methods:Oleanolic acid was sperated on an Hypersil ODS column.The mobile phase was methanolwater.The flow rate was 0.8 ml・min1with linear gradient. UV detection wavelength was 215 nm.Column temperature was 20 ℃.Results:Oleanolic acid was separated well. The relationship of injection amounts and peak was linear(r=0.999 9)in the range of 1.22～6.10 μg and the recovery rate was 98.8%.Conclusion:The method is simple,accurate and can be used for the quality study of Akebia trifoliate.
        Key words:Akebia trifoliate;Oleanolic acid;HPLC
        木通科木通属植物三叶木通 Akebia trifoliata(Thunb)Koidz的藤茎作为中药木通使用始载于《神农本草经》，味微辛苦，性寒。具有清热利尿、通经活络、镇痛、排脓、通乳的功效［1，2］。研究发现，齐墩果酸为苷元的五环三萜类皂苷是三叶木通主要有效成分之一［3］。关木通用药标准被取消后，三叶木通作为木通已在市场上逐渐恢复使用，为进一步研究、资源开发和药材质量控制提供依据，建立了高效液相色谱法测定三叶木通中齐墩果酸含量的方法，并对不同产地三叶木通的皂苷元齐墩果酸含量进行测定。
           1仪器与试药
        Agilent 1100高效液相色谱仪，包括：真空脱气机、四元泵、自动进样器、紫外检测器、柱温箱、化学工作站。
齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号0709―9803)三叶木通产地见表1，经四川农业大学植物教研室杨光辉鉴定为 Akebia trifoliata(Thunb)Koidz茎，甲醇(上海陆都化学试剂厂)为色谱纯，超纯水，乙醇、氯仿为分析纯。
        2方法与结果
        2.1色谱条件Hypersil ODS柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相A：水，B：甲醇，梯度洗脱0 min：AB(25∶75)，10 min：AB(10∶90)，20 min：AB(5∶95)，检测波长：215 min，流速：0.8 ml・min1柱温：20 ℃。在此条件下，对照品及样品的HPLC图谱见图1。
        a对照品b四川雅安三叶木通
        1.齐墩果酸
        图1高效液相色谱图（略）
        2.2溶液制备
        2.2.1对照品溶液的配制精密称取减压干燥至恒重的齐墩果酸对照品6.1 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度即得对照品溶液，浓度为0.61  mg・min1。
        2.2.2供试品溶液的制备采自各地的三叶木通多年生茎，60℃烘干，粉碎过40目筛，称取5.000 g，50%乙醇50 ml、功率1 200 W超声30 min后过滤，再加50 ml超声10 min，合并提取液，70℃减压浓缩至干，加1.5 mol・L1H2SO4液50 ml沸水回流水解4 h后，加氯仿15 ml再回流15 min，冷却后分液，用50 ml氯仿萃取，合并氯仿液，减压回收氯仿至干，加甲醇溶解并定容至25 ml备用。
        2.3线性关系考察齐墩果酸对照品溶液分别以2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μl进样分析，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样量(mg)为横坐标X，峰面积值为纵坐标Y，得回归方程：Y=4.933 3×105X4.484 0×107，r=0.999 9。结果表明齐墩果酸在1.22～6.10 μg与其峰面积呈良好的线性关系。
        2.4精密度实验用对照品溶液重复进样5次，每次5 μl，齐墩果酸峰面积值RSD为0.25%。
        2.5重复性实验取四川雅安产三叶木通样品5份，按供试品液方法制备，在上述色谱条件下进样测定，根据峰面积值，计算齐墩果酸的RSD为1.02%。
        2.6稳定性实验将样品溶液室温放置1，2，3，4，8 h后分别进样测定，结果样品溶液在8 h内稳定，齐墩果酸峰面积RSD为0.63%(n=5)。
        2.7加样回收率实验称取已测得齐墩果酸含量的四川雅安产样品2.5 g，共9份，每3份为1组，每组分别准确加入齐墩果酸对照品10.0，15.0，20.0 mg，按上述供试品溶液制备方法处理后，各进样5 μl，测定峰面积，结果每组齐墩果酸的平均回收率分别为101.2%，98.2%，97.1%，RSD分别为1.3%，0.8%，1.5%。3组平均回收率为98.8%(n=9)。
        2.8样品的测定对照品与供试品溶液各5 μl进样，按上述色谱条件测定，用外标法计算出样品中齐墩果酸含量。结果见表1。
           3讨论
        3.1波长的选择在200～400 nm范围内进行光谱扫描，发现齐墩果酸在203 nm处有最大吸收，但考虑到噪音导致的基线不稳，因此将215 nm作为测定波长。
        3.2流动相的选择样液中的未知杂质与齐墩果酸的极性相差不大，用单一的各种比例的流动相均无法将其很好的分离，本法采用梯度洗脱，能将其在15 min内完全分离。
        表1三叶木通中齐墩果酸的含量测定（略）
        3.3提取方法的选择比较了回流、超声和冷浸等提取方式，结果表明超声提取率高，且操作简便，因此选用超声提取法；紧接着采用正交试验对超声提取过程中的超声功率、超声时间和溶剂乙醇浓度进行了考察，结果表明：20倍50%乙醇溶液、1 200 W超声30 min，齐墩果酸的提取率最高。
        3.4水解方法的选择考察了水解酸浓度和水解时间对齐墩果酸含量的影响，结果表明1.5 mol・L1H2SO4液50 ml沸水回流水解4 h齐墩果酸得率最高。
           参考文献：
        ［1］吴贻谷.中华本草［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：128128.
        ［2］黄泰康，丁志遵，赵守训，等.现代本草纲目［M］.北京：中国医药科技出版社，2000：411412.
        ［3］王晔，鲁静，林瑞超.三叶木通藤茎的化学成分研究［J］.中草药，2004，35(5)：495498.
        (四川农业大学农学院，四川 雅安625014)