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       【摘要】 
       肾阳虚一直是中医研究的重点，并不断采用先进技术对肾阳虚证动物模型及其药物影响进行研究。近 50 年对肾阳虚证的研究认为，肾阳虚与神经内分泌系统（NEIS）有关。文章就肾阳虚动物模型在下丘脑-垂体-靶腺（肾上腺皮质、甲状腺、性腺和胸腺）轴不同环节、不同程度的功能紊乱，以及补肾中药对其影响的实验研究做了综述。
       【关键词】  肾阳虚 动物模型 补肾中药 下丘脑 垂体
       中医认为，肾为脏腑之本，十二经之根，先天之本在于肾。肾与命门本同一气，为人身阴阳消长之枢纽。因此，对肾阳虚证的研究一直是中医研究的重点。现代医学研究认为，肾阳虚证与神经内分泌免疫系统（NEIS）有关，肾阳虚证在下丘脑－垂体－靶腺（肾上腺皮质、甲状腺、性腺和胸腺）轴不同环节、不同程度的功能紊乱，且主要发病环节在下丘脑（或更高级）的调节功能紊乱［1］。还认为，肾阳虚证也意味着一定程度的未老先衰。随着科技的发展，越来越多地采用先进技术对肾阳虚证动物模型及其药物影响进行研究。本文仅就补肾中药对肾阳虚证动物模型影响的实验研究概况作一综述［2］。
       1  补肾中药对下丘脑－垂体－肾上腺皮质（HPA）轴的影响
          
       以促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）放射免疫分析法，观察温补肾阳代表药—附子的重要有效成分乌头碱对正常大鼠下丘脑CRH含量的影响。结果表明，正常大鼠在腹腔注射乌头碱不同剂量（1，3，10 μg）7 d后，下丘脑CRH含量呈剂量依赖性增高。免疫组织化学研究表明，乌头碱用药组下丘脑室旁核CRH阳性神经细胞及正中隆起CRH阳性神经纤维染色较对照组明显增多增深，且用药以中等剂量组最为明显。提示乌头碱可能直接兴奋下丘脑CRH的合成与分泌［1］。用分子生物学技术RT-PCR化学发光定量法研究肾阳虚大鼠，其HPA轴受抑，且下丘脑室旁核CRHmRNA的表达量明显比正常对照组减少［3］。以右归饮加减的补肾中药配方，采用RT-PCR半定量法检测下丘脑－垂体－肾上腺轴钙调素CaM mRNA的表达。结果：肾阳虚下丘脑、肾上腺CaM mRNA 水平升高，垂体CaM mRNA 水平无显著变化，而右归饮可降低下丘脑CaMmRNA 水平，但对肾上腺影响不明显，提示降低CaMmRNA 是其药物作用机理［4］。又以液体闪烁仪测定γ-32P-ATP蛋白激酶的活性。结果：肾阳虚大鼠下丘脑和肾上腺组织中钙调素蛋白激酶II（CaMPK-II）显著升高。右归饮对肾阳虚大鼠下丘脑和肾上腺组织升高的CaMPK-II活性有下调作用［5］。用32P-ATP掺入反应底物中的摩尔数表示蛋白激酶的活性，用放免法测定cAMP、cGMP含量，结果肾阳虚大鼠血浆中cAMP水平下降，cGMP升高，cAMP/cGMP比值降低，下丘脑组织中蛋白激酶PKA和PKC活性在胞液和胞膜中的活性较正常对照组明显降低。补肾药组血浆cAMP略升高，cGMP水平降低，cAMP/cGMP比值升高，且与模型组有统计学差异。补肾用药组下丘脑组织细胞中PKA活性升高，但与模型组无显著性差异，下丘脑组织胞液中PKC活性明显升高［6］。以免疫染色技术检测肾阳虚大鼠下丘脑－垂体－肾上腺轴c-Fos蛋白的表达。结果：肾阳虚大鼠下丘脑视交叉上核和肾上腺的c-Fos阳性细胞数显著升高，右归饮可抑制其升高，达到调整肾阳虚大鼠HPA轴的功能，抑制肾上腺细胞凋亡，从而改善肾阳虚症状［7］。利用扫描电镜分别观察下丘脑、垂体和肾上腺的超微结构，同时观察右归饮对其的影响。结果：肾阳虚大鼠模型组下丘脑正中隆起室管膜细胞界限不清，微绒毛分布改变，其顶端膨大呈球状，许多细胞部位出现孔洞，几乎未见分泌样颗粒结构，而补肾药组下丘脑正中隆起室管膜细胞排列整齐，细胞界限清楚，微绒毛粗细均匀，呈细长的绒线状，类似于正常组。由于下丘脑的许多神经分泌核团含有神经分泌颗粒的神经末梢终止于正中隆起，且正中隆起本身也有一些促垂体神经分泌细胞，因此正中隆起与下丘脑－垂体－肾上腺的分泌和调控密切相关［8］。电镜下模型组垂体ACTH细胞内质网扩张，线粒体空化，核形态正常,使ACTH合成分泌受抑，进而导致肾上腺结构损伤，肾上腺细胞核质比变大，细胞萎缩变小，脂滴显著变小，堆积在一些细胞中，而另一些细胞脂滴完全消失。表现为肾上腺束状带、网状带萎缩，糖皮质激素分泌受抑。补肾药组垂体ACTH细胞形态基本正常，细胞界限清楚，核形态完整，染色质均匀一致，线粒体、内质网与正常组类似。其肾上腺细胞超微结构的损伤略有改善，但不明显，基本类似于肾阳虚模型组。补肾中药能改善垂体超微结构的损伤，而调整垂体、肾上腺功能，改善肾阳虚症状［9］。用流式细胞仪和钙荧光探针研究细胞内钙信号在肾阳虚发病中的作用及补肾中药的调整作用。测定血淋巴细胞内Ca2+（［Ca2+］i）和血清钙。结果：肾阳虚大鼠下丘脑和血淋巴细胞［Ca2+］i及血清钙显著升高［10］。金匮肾气丸为补肾名方，以其不同浓度、不同时间来探讨肾阳虚大鼠垂体细胞增殖的影响。用3H-酪氨酸掺入检测垂体细胞转化，结果：金匮肾气丸高、中、低剂量组，在喂药后10，20，30 d，可见3H-酪氨酸标记的垂体细胞中合成蛋白质的量均有不同程度的增高，用药20～30 d后以中剂量组效果最为明显。提示金匮肾气丸对垂体细胞增殖有促进作用［11］。以RT-PCR检测垂体ACTH基因表达，结果以用药20～30 d后中、高剂量组ACTH mRNA表达上调最为明显［12］。研究蛇床子补肾壮阳作用，用蛇床子香豆素（TCR）和蛇床子素给肾阳虚大鼠用药，并测定其血浆皮质酮（B）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、肾素（PRA）、血管紧张素-II（AT-II）和醛固酮（ALD）浓度。结果：用药组大鼠血浆B和ACTH显著升高，但各组间PRA、AT-II和ALD浓度无显著性差异，提示TCR和蛇床子素具有保护和增强腺垂体－肾上腺皮质轴功能的作用［13］。
       2  补肾中药对下丘脑－垂体－甲状腺轴的影响
          
       甲状腺功能生理范围内或病理性降低是肾阳虚的主要病理之一，以甲基硫氧嘧啶造甲状腺功能低下的肾阳虚模型，显示胃黏膜有较明显的萎缩病变，胃体黏膜固有层厚度、胃体腺腺底相对厚度明显减少，胃体腺中性红染色增强，幽门黏膜核分裂相频数显著减少等［14］。研究金匮肾气丸对以氢化考的松所致动物模型，分为模型组、氢考＋补阳药组、氢考＋补阴药组、氢考＋金匮肾气丸组。结果：在给药7 d后，检测小鼠T3，T4水平，显示模型组T3，T4水平下降显著［15］，全匮肾气丸组可显著提高小鼠T3，T4水平，其可调节甲状腺轴的内分泌功能，而补阴药和补阳药对甲状腺轴有影响，虽二者无差异，但较肾气丸组的影响弱。观察参附注射液对甲状腺机能减退症（甲减）肾阳虚小鼠血清甲状腺素的影响，用他巴唑制备甲减肾阳虚模型，用放射免疫法测定小鼠血清T3，T4和促甲状腺素（TSH）浓度，结果模型小鼠血清T3，T4浓度均降低，TSH浓度升高，造模后用药组T3，T4浓度明显升高，TSH浓度降低，提示参附液可显著改善肾阳虚证候［16］。而以醋酸考的松造模15，23，30 d，其血中T3、T4浓度和TSH浓度明显低于正常组［17］。以电镜观察肾阳虚动物模型及补肾益气药影响的垂体、甲状腺组织的超微结构。结果：肾阳虚大鼠垂体促甲状腺激素（TSH）细胞、甲状腺滤泡上皮细胞出现内质网、高尔基体扩张、线粒体空化、细胞变形、核形态改变等，而补肾益气中药可减轻上述超微结构损伤，但对甲状腺细胞超微结构损伤的保护作用甚微［18］。以仙戟汤给予甲状腺功能低下动物，并用放射免疫测定兔血清TSH，T3，T4水平，同时比较甲状腺素片与仙戟汤组的TSH，T3和T4。结果：仙戟汤组和甲状腺素片组TSH，T3和T4无显著性差异，均显著高于肾阳虚模型组［19］。
       3  补肾中药对下丘脑-垂体-性腺轴的影响
           
       以腺嘌呤造大鼠肾阳虚模型，观察补肾生精汤对肾阳虚睾丸功能损害的影响。于造模后，连续服药10 d，间接3 d再服，共服药30 d。结果：补肾药组大鼠肾阳虚症状明显改善，生育力、精子质量和睾丸生精功能均显著提高，睾丸组织学近似正常，血中促黄体生成素（LH）、睾酮（T）、和皮质醇（F）水平显著升高，而促卵泡生成素（FSH）不变。与模型组相比差异显著。提示补肾生精汤具有壮阳生精和调节内分泌功能的作用［20］。以羟基脲造模型，用检测血中微量元素铜、锌、铁、镍、锰、钴、锶和皮质醇（F）来观察右归丸灌服后血中微量元素，均显著升高，可使其微量元素由平衡－失衡－再平衡［21］。仍以同前的建模方式，右归丸灌服后检测血中微量元素、血浆生化等，其指标为尿素氮（BUN）、肌苷（Cr）、谷丙转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、蛋白（TP）、总胆固醇（Tchol）和甘油三酯（TG）。结果：肾阳虚家兔全血微量元素含量均下降，TP和Tchol明显升高，BUN，Cr，LDH，TG等下降至正常范围。提示右归丸可对机体微量元素起整体平衡调节作用，也说明了血液微量元素是正确评价病证转归和药物疗效的重要指标［22］。观察以煅牡蛎、海龙、杜仲、巴戟天等7味中药组成的固延平散对肾阳虚小鼠的影响。结果：给药后可使肾阳虚小鼠体重、体温增加，游泳时间延长以及鼠睾丸重量增加［23］。观察鱼鳔补肾益精丸对肾阳虚小鼠的作用。结果可使大剂量皮质激素诱发的肾阳虚小鼠自主活动次数增加，游泳时间延长，体重、体温降低减少，使去势的大鼠前列腺、精囊、包皮腺明显增重，缩短阴茎勃起潜伏期，提高雄鼠的交配能力，改善神经性性功能障碍的性活动，有明显补肾壮阳作用［24］。观察以淫羊藿、蜈蚣等组成的健阳胶囊对肾阳虚小鼠和去势小鼠的影响。结果表明：其可增加鼠的自主活动次数、延长游泳时间、增加血中睾酮、增加其爬背次数和附性器官发育、增加体重和前列腺、包皮腺的重量、缩短阴茎勃起潜伏期［25］。探讨运动性低血睾酮与肾阳虚对骨骼肌α－actin基因表达的影响是否相同，以长时间大强度、较长时间游泳造成运动性低血睾酮，并以腺嘌呤造肾阳虚模型。结果：肾阳虚可通过抑制骨骼肌收缩蛋白基因表达影响大鼠骨骼肌功能，而运动性低血睾酮大鼠骨骼肌则未出现这种变化，故应慎用治疗肾阳虚中药来纠正运动性低血睾酮［26］。用电镜观察补肾益气中药对肾阳虚大鼠垂体－睾丸超微结构的影响。结果：以醋酸可的松造的肾阳虚模型垂体促性腺激素分泌细胞内质网、高尔基体严重扩张，线粒体固化，细胞固缩，睾丸曲细精管生精上皮细胞血睾屏障扩张，细胞中出现许多大小不等的空泡。补肾中药可改善垂体超微结构的损伤，但却不能改变睾丸超微结构的损伤［27］。观察以鹿茸、冬虫夏草、人参等药组成的的生精胶囊，以牛鞭、枸杞子、红参等组成的三宝双喜胶囊和由熟地黄、淫羊藿、金樱子、菟丝子等药组成的肾宝合剂对肾阳虚鼠的影响。结果：均能使幼龄雄鼠精子数增加、精子活力增强、性器官增重、活动度增加及雌鼠受孕率提高，胎仔数增多，有促进生育力的作用［28～30］。
       4  补肾中药对下丘脑垂体肾上腺胸腺（HPAT）轴的影响
          
       亦即对神经内分泌免疫（NEI）网络的影响。观察右归饮对皮质酮（CORT）造成的下丘脑垂体肾上腺胸腺轴抑制模型的调节作用。结果显示：模型大鼠HPAT轴从功能到形态出现抑制，血浆CORT及ACTH降低，脾细胞减少，淋巴细胞增殖反应减弱，室旁核促肾上腺皮质激素释放激素（CRF）神经元及正中隆起CRF神经纤维、垂体前叶ACTH细胞等免疫组化染色明显变淡，数量变少，肾上腺、胸腺萎缩，以右归饮灌胃14d 后，垂体、肾上腺及胸腺重量显著增加，且使肾阳虚病理改变减轻，有效提高血浆CORT及ACTH含量，还对模型大鼠脾细胞、淋巴细胞有促增殖作用［31］。进一步又观察了右归饮对皮质酮所致肾阳虚动物模型细胞免疫及细胞因子的影响。结果表明：模型大鼠免疫功能受抑，淋巴细胞增殖反应减弱，自然杀伤细胞（NKCC）活性降低，白介素2（ILII）、γ干扰素（INFγ）含量减少，在用药14d 后，体内外试验均显示模型大鼠淋巴细胞增殖反应增强，诱生ILII和INFγ水平也明显提高［32，33］。另外，还有以健脾益气药四君子汤和活血药桃红四物汤来观察对皮质酮所致HPAT轴抑制模型的影响。结果表明：四君子汤灌胃能有效改善神经免疫功能，可使肾阳虚模型下丘脑单胺类递质增高，还可提高其血浆CORT及ACTH的含量，并增强NKCC活性和提高淋巴细胞诱生IL-II和INFγ的能力，但桃红四物汤则无此作用［34］ 。进而又观察了补肾、健脾、活血三类复方对HPAT轴及CRF基因表达的影响。结果：唯有补肾药可通过上调下丘脑CRF mRNA表达来保护HPAT轴免受外源性皮质酮的抑制，健脾药则对免疫有直接的促进作用，活血药对HPAT轴无任何影响。此提示补肾药对肾阳虚证的主要调节点定位于下丘脑［35］ 。探讨六味地黄汤抗糖皮质激素诱导胸腺萎缩的作用。结果表明：模型组小鼠胸腺重量减轻、皮质变薄，而六味地黄汤组小鼠胸腺重量高于模型组，胸腺皮质较厚，提示该药有抗糖皮质激素诱导胸腺萎缩的作用［36］。免疫衰老与T细胞凋亡关系的研究已深入到基因水平，为了探讨枸杞多糖对老年大鼠T细胞过度凋亡及相关基因表达的调节作用，用流式细胞技术和荧光实时定量PCR技术研究了老年大鼠和年轻大鼠T细胞凋亡百分率及抗凋亡和促凋亡基因（抗凋亡基因：Bcl-2,肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）;促凋亡基因：Fas，Fas的天然配体FasL，TNFR1和Bax）mRNA的表达情况，并研究了枸杞多糖对老年大鼠T细胞凋亡百分率及对上述促凋亡基因和抗凋亡基因mRNA表达的影响。结果：枸杞多糖能有效地降低老年大鼠T细胞的过度凋亡，且可下调促凋亡的TNFR1,并上调抗凋亡的Bcl2基因的mRNA表达［37］ 。进而又研究用淫羊藿总黄酮（EF）延缓HPAT轴衰老的分子机制，用基因芯片技术分别检测EF组、右归饮组、桃红四物汤组、老年大鼠对照组及青年大鼠对照组下丘脑、垂体、肾上腺、脾脏淋巴细胞的基因表达谱。结果表明：老年大鼠和青年大鼠相比，HPAT轴多种神经递质、激素、细胞因子或其受体表达下调；EF组HPAT轴多种神经递质、激素、细胞因子或其受体表达上调；右归饮及桃红四物汤组未见广泛的调节作用。提示老年大鼠HPAT轴与生长、发育、衰老相关的基因表达以衰退的表现为主；EF能上调神经递质受体的表达并通过NEI网络的下行通路激活神经内分泌和免疫系统；通过下调促凋亡、抗增殖基因，上调抗凋亡、促增殖基因的表达，重塑淋巴细胞基因表达平衡，延缓免疫衰老［38，39］ 。用基因芯片研究老年大鼠与青年大鼠HPAT轴差异表达基因，结果表明：老年大鼠下丘脑多种神经递质或其受体如γ氨基丁酸A受体（GABA-AR）、α1肾上腺素受体（α1ER）、谷氨酸受体（GluR）、多巴胺转运蛋白表达下调，垂体多种促性腺激素包括FSH、LH和促性腺激素释放激素下调；生长激素和生长激素释放因子受体下调；脾淋巴细胞促凋亡基因Caspase1， Caspase3，Cpp32β等表达显著上调，抗凋亡基因cathepsin B、MTA1下调，抗增殖基因 Rb，BTG1表达上调，促增殖基因Jagged 1及cmyc1，cfos，Cyclin B1(细胞周期蛋白B1)等基因表达下调。提示：衰老时HPAT轴的衰退以下丘脑－垂体－性腺轴、下丘脑－垂体－生长激素轴、免疫系统受损最为明显。神经递质、生长激素、促性腺激素基因低表达及免疫细胞促凋亡基因高表达而抗凋亡基因低表达，促增殖基因低表达而抗增殖基因高表达是受损的分子机制［40］。
       
       由NEI网络领衔的肾阳虚反映了统率全身的最大网络，这样就不至于把肾或命门局限在某个脏器或某个腺体，且宏观和微观取得统一，正常的人体结构是人类基因的一个有序的表达，疾病则是基因表达的失衡。对疾病的治疗都将从调控基因的功能着手。证是一种多基因参与的功能态，故其本身就是一种基因调控网络的表现，对此网络需以基因芯片为手段，研究该证基因表达谱，若以中药干预，既可由此纠正基因网络失衡，以“差异分析”找到基因表达差异谱，同时还可“以药测证”，观察与该证相关基因群之活动规律，并阐明证的本质［41］。由此东西方医学将汇合在DNA双螺旋体上［42］ 。中医证候基因组研究，尤其是肾阳虚证基因组研究，引入生物信息学和信息融合，可将多源性、多层次、多性质、多方面的肾阳虚证治数据进行总结并前瞻设计信息的最佳组合，形成数学模型以揭示其规律［43］。
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