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       【摘要】 
       目的探讨鼻渊舒口服液对急性鼻窦炎大鼠鼻黏膜中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的影响。方法用不同剂量的鼻渊舒口服液治疗急性鼻窦炎大鼠，同时应用其他常规用药作比较，最终以大鼠鼻黏膜的病理切片观察为探讨依据。结果鼻渊舒口服液可以降低大鼠鼻黏膜中的TNF-α。结论鼻渊舒口服液可以通过调节TNF-α与受体结合和受体后信号传导，下调黏附分子和趋化因子的表达和分泌，减弱白细胞的粘附、游出和聚集，从而发挥抗炎作用，促进急性鼻窦炎的痊愈。
       【关键词】  急性鼻窦炎 肿瘤坏死因子α 鼻渊舒口服液
       The Influence of BiYuanshu Oral Liquid on Rat TNF α Expression of Acute Sinusitis nasal Mucosa
       YUAN Xiao-hui, XIONG Da-jing, YANG Xu, WEI Rui
       (Second Hospital of Beijing General Brigade;Chinese People"s Armed Police Forces;Beijing 100037, China; Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 610075, China)
       Abstract:ObjectiveTo study the influence of BiYuanshu Oral Liquid on rat TNF-α  expression of acute sinusitis nasal mucosa.MethodsAcute simsitis was treated with BiYuarshu oral liquid in different doses and the pathological section of rat rasal mucosa was observed.ResultsBi Yuanshu Oral Liquid could reduce rat TNF-α  expression of nasal mucosa.ConclusionBi Yuanshu Oral Liquid can adjust the combination and conduction of TNF-α  with its receptor, inhibit the expression and secretion of adhesion molecule and chemotatic factor,attenuate sticking,emigration and aggregation,therefore it can exert its anti-inflammatory effect,and promote the recover of acute sinusitis.
       Key words:Acute sinusitis;  Tumor necrosis factor α;  BiYuanshu Oral Liquid
       
       “鼻渊舒口服液”是熊大经教授在家传秘方的基础上，根据《素问·气厥论》［1］中“胆移热于脑，则辛頞鼻渊，鼻渊者，浊涕下不止也”的理论，结合三十余年的临床经验而组成的验方。临床应用近30年，现由成都华神制药厂生产，疗效确切，深受国内外患者的青睐。本课题旨在通过研究，从实验的角度客观评价“鼻渊舒口服液”对鼻窦炎的治疗机理，为临床用药提供客观的理论依据。
       1  材料
       1.1  药物鼻渊舒口服液的制备，由成都华神制药厂生产，主要由黄芩、龙胆草、白芷、柴胡、苍耳子、辛夷、黄芪、川芎等组成。稀化粘素，德国保时佳大药厂生产， 进口注册证号：X980578。青霉素V钾片，长春市新安制药厂生产，批号：133589。
       1.2  动物 SD大鼠90只，一级动物，体重200～250 g，3月龄，雌雄各半，四川大学华西医学中心实验动物中心提供，合格证号：川实动管第70号。饲养于成都中医药大学附属医院药理实验中心，室内温度由空调控制在20～25℃。
       
       1.3  试剂TNF-α（N-19）一抗购自Santa  Cruz  Biotechnology 公司，其二抗以及试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。
       2  方法
       2.1   动物分组   自由喂养 1 周后，将实验动物随机分为①中药高剂量组；②中药中剂量组；③中药低剂量组；④西药1（稀化粘素）组；⑤西药2（青霉素V钾）组；⑥西药+中药组；⑦模型组；⑧假模型组；⑨空白组。每组10只，共90只。
       2.2  急性鼻窦炎大鼠模型   依据Y. Ge1［2］的方法制造模型改进。腹腔注射盐酸氯胺酮5 mg/100 g体重,必要时用一般剂量重复 1 次，做全麻。用盐酸利多卡因20 mg/ml,配肾上腺素0.012 5 mg，作鼻背下注射麻醉。剃毛，用碘伏消毒备皮，在面中线上中1/3交界处旁开3 mm以45°角进针1.5 mm置石蜡适量于内封口；然后塞入适量带有金黄色葡萄球菌的明胶海绵于内，由于是微创，不必缝合。以上过程应在显微镜下操作，以确保动作到位。假模型组造模方法同上，但注入明胶海绵的不是金黄色葡萄球菌，而是生理盐水。
       2.3   给药    从造模成功后的第1天开始灌胃，疗程时间为7 d，灌胃情况如下：
       2.3.1  中药高剂量组 每日以相当于临床成人剂量20倍的鼻渊舒口服液〔相当于鼻渊舒口服液10 ml/(kg·d）-1〕灌胃，分早晚两次灌服。
       2.3.2  中药中剂量组 每日以相当于临床成人剂量10倍的鼻渊舒口服液〔相当于鼻渊舒口服液5 ml/(kg·d）-1〕灌胃，分早晚两次灌服。
       2.3.3  中药低剂量组 每日以相当于临床成人剂量5倍的鼻渊舒口服液〔相当于鼻渊舒口服液2.5 ml/(kg·d）〕灌胃，分早晚两次灌服。
       2.3.4  西药1组每日以相当于临床成人剂量5倍的稀化粘素〔相当于稀化粘素75 mg/（kg·d）〕灌胃，分早晚两次灌服。
       2.3.5  西药2组每日以相当于临床成人剂量5倍的青霉素V钾〔相当于青霉素V钾 125 mg/（kg·d）〕；灌胃，分早晚两次灌服。
       2.3.6  假模型组每日以与用药组等容（2 ml/d）的生理盐水灌胃，分早晚两次灌服。
       2.3.7  模型组每日以与用药组等容（2 ml/d）的生理盐水灌胃，分早晚两次灌服。
       2.3.8  空白组不灌胃
       2.3.9  中药+西药组每日以临床成人剂量6倍的鼻渊舒口服液（浓度0.815 925 g/ml）2～3 ml和含药量相当于150 mg·kg-1·d-1的青霉素与稀化粘素灌胃，分早晚二次灌服。给药方法参照《中药药理实验方法》［3］。
       2.4   检测方法首先要及时把取下的鼻黏膜放在固定液中保存，经脱钙后，按照下列步骤进行：①石蜡切片脱蜡至水，用PBS液（0.01 mol/L pH7.4）冲洗3次×5 min。②3%H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性,室温下孵育10 min。③蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。④10%的正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min。倾去血清，勿洗，滴加1：100比例稀释的一抗，37℃孵育1 h。⑤PBS冲洗，5 min×3次。⑥滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30 min。⑦PBS冲洗，5 min×3次。⑧滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。⑨PBS冲洗，5 min×3次。⑩显色剂显色（DAB或AEC）。然后用自来水充分冲洗，苏木精复染，封片。
       
       用显微镜结合计算机图形图像分析系统，在200×光镜下，随机选取3个视野进行面积、积分光密度、平均黑度的测量。
       
       计量资料以±s表示，用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。
       3  结果
          
       模型组大鼠鼻黏膜TNF-α积分光密度、平均光密度分别与测量视野面积和的比值，明显高于正常对照组（P<0.01）；平均黑度值明显低于正常对照组（P<0.01）；但黄染面积与面积总和的比值无统计学意义。
       
       与空白组相比：①积分光密度/面积总和的比值，中药低、中剂量组、西药一组、假模型组无显著性差异（P>0.05），其中以中药低剂量组最为接近；②黄染面积/面积总和的比值，无统计学意义；③平均光密度与面积总和的比值，西药1组、中药低剂量组、西药2组无显著性差异（P>0.05）。④平均黑度，中药低、中组，西药1，2组无显著性差异（P>0.05）。结果见表1。
       表1  各组鼻黏膜中TNF-α有关项目的比较（略）
       与空白组比较，△ P<0.05，△△P<0.01;与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；n=6
       4  讨论
          
       肿瘤坏死因子（TNF）是一种重要的调节机体免疫功能和代谢过程的多功能细胞因子，可分两类，TNF-α(又称恶液质素)是由致敏的单核/巨噬细胞产生的；另一种TNFβ主要由活化的T淋巴细胞产生，又称淋巴毒素。
       
       本研究之所以选择指标TNF，是因为其是炎症过程中的重要促炎因子，作用主要表现在：① 由于TNF能激活中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞，故可推测其在体内炎症前期有一定作用、现众多报道证实在许多炎症性疾病中TNF水平是增高的。② 抗细菌作用:服用TNF可防止动物由于单核细胞增多性李斯特菌感染的致命作用，TNF抗多种细菌及寄生虫感染是由于其能激活中性细胞、巨噬细胞及嗜酸性粒细胞。另外，TNF在杀灭细菌的肉芽肿形成中起着关键作用。③自身免疫性:由于TNF基因位于MHc内，自身免疫性疾病发展过程中不能排除有异常TNF基因的参与。已证实，TNF参与痤疮性肾炎的病理过程，其限制性片段长度多态性与TNF产量下降有关，TNF替代疗法能推迟肾炎的发生。④伤口愈合:与其他来源于巨噬细胞的细胞因子如成纤维细胞生长因子(FGF)和TGF-β一样，由于TNF能刺激新生血管形成和刺激成纤维细胞作用，故TNF在伤口愈合中起着重要作用。   
       
       TNF在体内具有双重作用，局部适量产生对机体有利，若大量产生则可导致严重病理损害，特别是TNF在各种疾病，如中毒性休克、器官移植排斥反应和自身免疫性疾病的病理生理中起着主要作用。由于体内产生过多的TNF对机体有害，可使中毒性休克加重而死亡，人们就设法抑制TNF在体内生成或阻断TNF与靶细胞结合，从而就有生物合成的小分子量TNF拮抗剂、抗TNF抗体、抗TNF受体抗体和可溶性TNF受体拮抗剂的研究。
       
       TNF-α不仅可作为宿主防御、免疫以及内环境稳定等生理过程的介质，还是感染、炎症及损伤的病理因子。其通过自分泌或旁分泌方式在局部调节白细胞和内皮细胞的功能、诱发炎症反应过程中起重要作用。TNF刺激内皮细胞合成产生E-选择素并在细胞表达、介导与嗜中性粒细胞、单核细胞和某些淋巴细胞的相应受体结合，从而发生粘着：上调内皮细胞的两类免疫球蛋白类粘附分子ICAM-1和血管粘附分子1（VCAM-1）的表达，增强白细胞（起初是噬中性粒细胞，随后是单核细胞和淋巴细胞）与内皮的粘着。TNF-α同时可上调趋化因子如IL-8的表达。通过以上诸多生物学作用促进白细胞粘着、游走、趋化、从而在炎症部位聚集；诱导其脱颗粒，释放溶酶体；同时通过自分泌方式作用于巨噬细胞本身而释放炎症介质（白细胞三烯，前列腺素等）促进炎症反应［4，5］。
       
       本实验中，主要是采用组织病理学的观察和测定，通过病理切片中黄染区域的面积、积分光密度、平均黑度和平均光密度的测定来间接反映TNF-α含量的变化。上表数字说明：鼻渊舒口服液可以降低大鼠鼻黏膜中的TNF-α，从而降低其促炎症效应，我们推测这可能是通过调节其与受体结合和受体后信号传导，下调粘附分子和趋化因子的表达和分泌，减弱白细胞的粘附、游出和聚集，从而发挥抗炎作用，促进急性鼻窦炎的痊愈。
       【参考文献】
         　　［1］ 杨上善. 黄帝内经太素［M］. 北京：人民卫生出版社，1965：217.
       
       ［2］ Y. Ge1, T. Tsukatani, T. Nishimura, M. Furukawa and T. Miwa. 2002© Oxford University Press 2002 Chem. Senses 27：521.
       
       ［3］ 陈 奇,沈映君,周金黄.中药药理实验方法［M］.北京:人民卫生出版社,1994:205.
       
       ［4］ 朱云松．细胞因子与急性胰腺炎［J］.国外医学·内科学分册， 2001，28(9)：384.
       
       ［5］ 汪 言，赵忠文，王立波．前列腺液中细胞因子（IL-6, TNF-α）在慢性前列腺炎中的意义［J］.白求恩医科大学学报，1999, 25 (4)：402.