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       【摘要】 
       目的应用基因芯片及酶链免疫、免疫组化技术研究鼻渊舒口服液对实验性急性鼻窦炎（ARS）大鼠白细胞介素（IL）-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响及其可能分子生物学机制。方法SD大鼠随机分为模型组、治疗组和正常组。模型组和治疗组依据Y. Ge1的改良方法造模，正常组不做任何处理。造模成功后治疗组给予鼻渊舒口服液灌胃1周，处死动物，取血及鼻黏膜用分别用酶链免疫及免疫组化测血和鼻黏膜中IL-6和TNF-α的表达情况；取肝脏抽提总RNA，纯化后的mRNA进行逆转录制备杂交探针，选用Oligo-60S芯片，对鼻渊舒口服液治疗ARS大鼠的差异表达基因谱进行初步研究和分析。结果鼻渊舒口服液能显著降低ARS大鼠血中IL-6和鼻黏膜TNF-α表达，发现了与鼻渊舒口服液治疗作用直接相关的24条差异表达基因。结论首次证明鼻渊舒口服液可能从细胞内PKC信号传导途径影响ARS大鼠IL-6和TNF-α的表达。
       【关键词】  急性鼻窦炎 鼻渊舒口服液 差异表达基因 白细胞介素-6 肿瘤坏死因子-α
       急性鼻窦炎（Acute Suppurative Sinusitis，ARS）是鼻窦黏膜的炎症性疾病，若急性期不及时治疗常迁延为慢性，严重影响患者健康。鼻渊舒口服液是著名中医耳鼻喉专家熊雨田先生结合数十余年的临床经验而组成的验方，临床疗效确切。以往从免疫、生化等方面对其药理学机制进行了较为深入的研究，但其治疗ARS过程中对机体基因表达影响的研究尚未见报道。本实验应用基因芯片及酶链免疫、免疫组化技术，对鼻渊舒口服液治疗ARS大鼠的差异表达基因谱及部分细胞因子的变化进行初步研究和分析，为阐明鼻渊舒口服液治疗ARS的分子生物学提供一定的理论依据。
       1  材料和方法
       1.1  ARS大鼠动物模型的制备及指标检测
       1.1.1  实验动物和菌种SD大鼠30只，一级动物，体重200～250 g，青年，雌雄各半，华西医科大学实验动物中心提供，合格证号：川实动管第70号。按Ⅱ级生物安全标准无菌饲养雌雄分养,每箱2只,饲料和饮水高压消毒。金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC，四川省卫生干部学院微生物教研室研究制备，批号：25935）。
       1.1.2  动物接种和分组自由喂养1周后，参考Y. Gel ［1］的方法改良进行造模，具体如下：按体重、性别随机选取20只大鼠按0.5 mg/kg腹腔注射盐酸氯胺酮全身麻醉，同时用盐酸利多卡因1.5～2.0 ml（20 mg/ml）,配肾上腺素0.012 5 mg，作鼻背下浸润麻醉，将大鼠头部固定于实验台，碘伏消毒备皮，于手术显微镜下在面中线上中1/3交界处旁开3 mm以45角作切口，扩大手术视野，然后塞入带有金黄色葡萄球菌的明胶海绵于内，缝合切口。待动物清醒后送回动物室饲喂。造模第7天，所有接种大鼠出现清涕、喷嚏、鼻前庭皮肤水肿或潮红，搔抓鼻部频繁，鼻黏膜的分泌物转为脓性。正常组动物未见异常。检测造模大鼠一般情况、体温、白细胞(WBC)计数及中性粒细胞(N)百分比、组织生化及组织病理指标，证实此次造模是成功的。
       
       造模后第7天将成功造模大鼠随机分为金黄色葡萄球菌感染模型组（简称模型组）和金黄色葡萄球菌感染模型＋鼻渊舒口服液治疗组（简称治疗组）。另设10只正常大鼠作为正常对照组。
       1.1.3  给药方法从证实造模成功后的第1天开始，治疗组每日予鼻渊舒口服液5 ml/kg（相当于临床成人剂量7倍）［2］早晚两次灌胃，疗程时间为7 d，模型组每日予生理盐水2 ml灌胃，正常组不灌胃。
       1.1.4  标本的采集与处理在给药1周后的第8天上午9：00～10：00间将模型组、治疗组和正常组大鼠股动脉取血处死，超净台冰盘上迅速摘取肝脏，Rnase free液冲洗两次，锡箔包好，置于液氮罐中保存。
       1.1.5  指标检测和统计学处理全自动生化分析仪检测大鼠白细胞（WBC）及中性粒细胞百分比（N），用双抗夹心ABC-ELISA法检测大鼠血清中白细胞介素（IL-6）含量；大鼠鼻黏膜切片经肿瘤坏死因子-α（TNF-α）免疫组化染色后在Mias-2000图像分析系统下计算积分光密度。计量资料以±s表示，用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析。
       1.2  芯片检测
       1.2.1  芯片制备选用含5705条大鼠全长互补DNA(complementary DNA，cDNA)的Oligo-60S芯片，生物芯片国家工程研究中心提供。
       1.2.2  组织处理参考Schena等［3］的方法抽提总RNA，具体方法是:将液氮保存的模型组、治疗组和正常组组织放在100 mm陶瓷碾体（RNase free）低温下彻底碾碎成粉末，加入Trizol试剂，制备成匀浆溶液，离心后，上清液经1∶1酚-氯仿两次抽提，3 mmol/L naAc和5∶1酸性酚-氯仿抽提，经等体积异丙醇沉淀，离心，75%乙醇洗涤沉淀，Miui-Q水溶解沉淀两次。
       1.2.3  mRNA的分离用RNeasy mini spin column试剂盒（Qiagen公司）对总RNA进行过柱纯化，最后用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检，得到纯的mRNA。
       1.2.4  探针标记参照Schena等［3］的方法逆转录标记cDNA探针并纯化，第1次用Cy3-dUTP标记正常组鼻黏膜组织的mRNA，用Cy5-dUTP标记模型组鼻黏膜组织的mRNA。第2次用Cy3-dUTP标记治疗组鼻黏膜组织的mRNA，Cy5-dUTP标记模型组鼻黏膜组织的mRNA。
       1.2.5  杂交与清洗选用大鼠的12个看家基因作为阳性对照，12个人工合成的与大鼠基因没有同源性的70 mer Oligo DNA作为阴性对照，以及拟南芥的3个基因作为外标。两次标记的DNA溶于30 ml杂交液中（3×SSC, 0.2%SDS, 5×Denhart"s, 25%甲酰胺），于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2% SDS，2×SSC的液体中洗5 min，而后在0.2×SSC中室温洗5 min。玻片甩干扫描。
       1.2.6  测定与分析芯片用ScanArray Express双通道激光扫描仪进行扫描，采用GenePix Pro 4.0 图像分析软件对Cy3和Cy5 两种信号的强度和比值进行分析。根据12个看家基因的光比率调整两种荧光的均衡［4］。然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化。
       2  结果
       2.1  一般状况、白细胞(WBC)计数及中性粒细胞(N)百分比比较造模后第7天，所有接种大鼠出现清涕、喷嚏、鼻前庭皮肤水肿或潮红，搔抓鼻部频繁，鼻黏膜的分泌物转为脓性。正常组动物未见异常。检测接种大鼠一般情况、体温、白细胞(WBC)计数及中性粒细胞(N)百分比（见表1）证实造模成功。
       表1  造模第7天大鼠WBC计数，中性粒细胞（N）百分比及体温比较（略）
       与正常组比较，△P<0.05，造模组指所有造模时注入细菌的大鼠
       
       灌胃7 d后模型组两只大鼠因双肺严重感染死亡，其余大鼠鼻分泌物无明显改善，WBC计数、中性粒细胞百分比（N）较正常组显著增高（P<0.01）。治疗组一只大鼠因灌胃不当致窒息死亡，其余大鼠鼻分泌物显著减少，WBC计数、中性粒细胞百分比（N）较模型组显著降低（P<0.01），与正常组相比无显著性差异。结果见表2。
       表2  用药7 d后各组WBC，中性粒细胞（N）百分比的比较（略）
       与正常组比较，△△P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.01 
       2.2  血清IL-6含量变化灌胃7 d后模型组大鼠血清IL-6含量显著高于正常组（P<0.05），治疗组大鼠血清IL-6含量显著低于模型组（P<0.05），与正常组比较无显著差异。结果见表3。
       表3  用药7 d后各组大鼠血清IL-6含量比较（略）
       与正常组比较，△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05
       2.3  鼻黏膜TNF-α含量变化灌胃7d 后模型组大鼠鼻黏膜TNF-α积分光密度显著高于正常组（P<0.05），治疗组大鼠鼻黏膜TNF-α积分光密度显著低于模型组（P<0.05），与正常组比较无显著差异。结果见表4。
       表4  用药7 d后各组大鼠TNF-α比较（略）
       与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05
       2.4  基因芯片检测
       2.4.1  组织RNA提取、纯化质量检测结果见图1。由图1可见3组动物组织提取的RNA样品的电泳图上18S与28S条带清晰，无DNA杂带，说明组织RNA提取及纯化的质量合格，可以用于进行芯片的检测。
       2.4.2  基因表达谱特征在基因表达谱的散点图上，每一个点表示一个基因，X轴和Y轴分别表示Cy3和Cy5的信号强度，Ａ线表示Cy3和Cy5两种荧光强度比值为1的斜线,B线和C线之间的散点表示表达无差异的基因，B线以上的散点表示与Cy3标记组比较表达上调的基因，C线以下的散点表示与Cy3标记组比较表达下调的基因。在双色荧光扫描图像中红点和绿点分别代表鼻黏膜组织高表达和低表达的基因，黄色的点表示该基因在鼻黏膜组织中表达差异不显著。见图2～5。
       图1RNA 电泳图（略）
       图2正常组与模型组杂交信号强度散点图（略）
       图3正常组与模型组双色荧光标记图（略）
       图4模型组与治疗组杂交信号强度散点图（略）
       图5模型组与治疗组双色荧光标记图（略）
       2.4.3  鼻渊舒口服液治疗ARS大鼠的差异表达基因将正常组与模型组组织RNA样品杂交，治疗组与模型组组织RNA样品杂交，再根据两次芯片检测的结果，求其交集，最终得到了24条在两次芯片检测结果中共有的差异表达基因。这24条基因就是鼻渊舒口服液治疗实验性ARS大鼠的24条与鼻窦炎直接相关的差异表达基因。结果见表5。
       表5  鼻渊舒口服液治疗实验性ARS大鼠的24条与鼻窦炎直接相关的差异表达基因（略）
       3  讨论
          
       ARS是鼻窦黏膜的急性感染性炎症性疾病，其发生发展和转归与细胞因子有着密切的关系。细胞因子（cotokine, CK）主要是由活化的免疫细胞和某些基质细胞（如骨髓基质细胞）分泌的一类具有非特异性调节免疫应答和介导炎症反应的小分子肽类物质，包括白介素（IL）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）、转化生长因子（TGF）家族和趋化因子家族（chemokine family）等。正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体严格的调控，在炎症的发生发展的过程中，自始至终都有细胞因子的异常表达。顽固的细胞因子活化和伴随而至的组织损伤形成恶性循环，是炎症中极难解决的问题。IL-6能促使Ｂ淋巴细胞增殖、分化成浆细胞并产生IgM、IgG和IgA等抗体，而且是B淋巴细胞产生抗体所必需的，在T细胞被抗原刺激后，IL-6协同IL-2促进T细胞分化成熟，IL-6还具有促炎因子的作用，可增强炎症介质对组织的损害［5］。TNF-α主要是由激活的单核-巨噬细胞产生的一种细胞因子，是一种重要的促炎因子和免疫调节因子［5］，可增强PMN，淋巴细胞与内皮细胞的黏附，PMN与内皮细胞结合后可通过释放过氧化物导致内皮细胞损伤，淋巴细胞通过直接杀伤作用或增强免疫反应造成内皮细胞损伤，TNF-α还能促进PAF的释放，从而增强血管内皮细胞的通透性，加重炎症损伤。
       
       本次实验发现有24条基因是鼻渊舒口服液治疗实验性ARS大鼠与鼻窦炎直接相关的差异表达基因，其中蛋白激酶C（Protein kinase C）基因，模型组表达上调，治疗组较模型组表达下调，蛋白激酶Ｃ(PKC) 是依赖Ca2+，磷脂(PL)和二酰基甘油(DAG)激活的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)的蛋白激酶的多基因超家族，是细胞内信号转导中的关键部分。Kucik［6］研究发现PKC表达增加可促进IL-6 mRNA合成。Majori［7］研究证实巨噬细胞PKC激活，可使TNF-α释放增加。因此模型组大鼠血清IL-6含量增加与鼻黏膜TNF-α增加，其分子生物学机制可能是造模后Prkcg基因表达上调，PKC转录增加，磷酸化的PKC相应增加，促进IL-6 mRNA合成及巨噬细胞释放TNF-α所导致。治疗组大鼠血清IL-6含量及鼻黏膜TNF-α与模型组相比显著下降，其分子生物学机制可能是鼻渊舒口服液治疗后Prkcg基因表达显著下调，PKC转录下降，磷酸化的PKC减少，IL-6 mRNA合成及巨噬细胞释放TNF-α减少导致。
       
       总之，本实验首次运用基因芯片技术从分子生物学机制初步证实，鼻渊舒口服液能够在基因表达和细胞内信号传导水平抑制急性鼻窦炎时细胞因子释放，减轻炎症反应和免疫细胞对正常组织的损害，起到调节炎症反应，保护正常组织的作用。其详细机制有待更进一步研究。另外，基因芯片技术能高通量筛选出中药治疗的相关靶点，这一技术必将对进一步揭示中医中药治疗的科学本质有推动作用。
       【参考文献】
         　　［1］ Y Ge1, T Tsukatani, T Nishimura, M Furukawa and T Miwa. Cell Death of Olfactory Receptor Neurons in a Rat with Nasosinusitis Infected Artificially with Staphylococcus［J］.Oxford University Press 2002 Chem Senses, 2002，27: 521.
       
       ［2］ 沈映君.中药药理学［M］.北京：人民卫生出版社，2000: 96.
       
       ［3］ Schena M, Shalon D, Heller R, et al. Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes［J］.Proc latl AcadSci USA,1996,93: 10614.
       
       ［4］ Schena M, Shalon D, Davis RW, et al. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray［J］.Science，1995,270: 467.
       
       ［5］ 何球藻, 吴厚生.医学免疫学［M］.上海：上海医科大学出版社，2000: 79.
       
       ［6］ Kucik DF. Jclin Invest, 1996;97: 2139.
       
       ［7］ Majori M. Eur Respir J, 1998;11:133.