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       【摘要】 
       目的建立乌达巴拉-7中胆酸的定量分析方法。方法双波长薄层扫描法。结果线性范围为1.065～5.325 μg，回归方程为Y=10 073.664X-2，r=0.999 1。在线性范围内，实验结果的精密度和重复性良好。平均回收率为99.1%, RSD为 0.91%（n=5）。结论该方法简便、灵敏、准确，可用于乌达巴拉-7中胆酸的含量测定。
       【关键词】  乌达巴拉-7 胆酸 薄层扫描法
       Determination of Cholic Acids in Wudabala-7 with Thin Layer Scanning Method
       WANG Yuhua,   ZHAO Guoding,ZHONG Naigeng, WANG Wei
       (Pharmaceutical School, Inner Mongolian Medical College, Huhhot 010059,China； Inner Mongolia Autonomous Region Hospital，Huhhot 010020,China；Inner Mongolia Imstitute for Drug Control,Huhhot 010020,China)
       Abstract:ObjectiveTo establish a method for determination of cholic acids in Wudabala-7. MethodsDouble wavelength thin layer scanning method was employed.Results The linear range was：1.065 ～5.325 μg；Regression equation was Y=10 073.664X-2，r=0.999 1.The method was accurate and reproducible within the liear range. Everage recovery was 99.1%, RSD was 0.91%（n=5）.ConclusionThis method is simple, sensitive and accurate, which can be used to determine the content of cholic acids in Wudabala-7.
       Key words:Wudabala-7；  Cholic acids ；  Thin layer scanning method
       
       乌达巴拉-7是蒙医常用的凉血、清“协日”的药物，是由牛黄、五灵脂、红花等7味药组成的复方制剂［1］。因为内蒙地区是此类病的高发地，乌达巴拉-7对这类病有较好的治疗作用,因此该药在临床上被广泛应用。由于乌达巴拉-7的质量标准中没有定性和定量的内容，该药的质量不能得到有效的控制，直接影响了临床用药的安全和有效。本实验采用双波长薄层扫描法对君药牛黄建立了含量测定的方法。
       1  仪器与材料
          
       岛津CS－930型双波长薄层扫描仪（日本）；PBQI型薄层自动铺板器（重庆南岸新力实验电器厂）。 胆酸对照品(批号：1523－200001，自中国药品生物制品检定所购入)；硅胶G（青岛海洋化工厂）； 其它试剂均为分析纯。
       
       乌达巴拉-7（内蒙古通辽蒙药厂，批号20041112  20041214  20041226 ）；模拟处方（自制）。
       2  方法
       2.1  薄层展开及扫描条件的选择
       2.1.1  薄层板制备用0.5%CMCNa：硅胶G（3∶1）湿法铺板，厚度为0．5 mm，晾干，于110℃活化1 h备用。
       2.1.2  展开剂异辛烷－醋酸乙酯-冰醋酸-甲酸（8∶4∶2∶1）。
       2.1.3  显色剂喷10%的硫酸乙醇溶液，105℃加热显色。
       2.1.4   扫描方式反射法锯齿扫描，SX=3，狭缝1.2 mm×1.2 mm。
       2.1.5  测定波长与参比波长的选择将显色后的斑点在400～700 nm范围内作光谱扫描，见图1。由图1确定胆酸斑点的测定波长和参比波长分别为：λs= 470 nm，λR= 650 nm。
       图1  胆酸斑点的光谱扫描图（略）
       2.2  提取条件的选择胆酸易溶于甲醇中， 故选择甲醇做为提取溶剂。 进一步将样品进行了如下的净化处理：将甲醇提取液过滤，精密吸取续滤液一定体积，蒸干，用碱回流提取，将碱回流提取液酸化，用醋酸乙酯提取，提取液蒸干，残渣加甲醇溶解定容。
       2.3  溶液的制备
       2.3.1   胆酸对照品溶液的制备取胆酸对照品约 5 mg，精密称定置 5 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升中含胆酸 1 mg）。
       2.3.2   供试品溶液的制备 取本品细粉约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称重，超声处理30 min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 ml，蒸干，残渣加20%NaOH溶液10 ml，加热回流2 h，冷却，加稀盐酸19 ml调节PH至酸性，用醋酸乙酯提取4次(25，25，20，20 ml ),每次醋酸乙酯液均通过同一铺有少量无水硫酸钠的脱脂棉滤过,合并提取液,蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至10 ml量瓶中, 加甲醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
       2.4   线性关系考察用定量毛细管吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 μl 胆酸对照品溶液（浓度为 1 mg/ml ）点于同一硅胶G薄层板上，按上述条件展开，定位，扫描，以斑点面积积分值对点样量（μg）之间做回归分析，用最小二乘法求得回归方程为Y=10 073.664X-2，r=0.999 1（Y为吸收度积分值，X为标准品的量：μg）。线性范围：1.065 ～5.325 μg。 标准曲线见表1和图2。
       表1  标准曲线测定的数据表（略）
       图2  胆酸测定的标准曲线（略）
       2.5  精密度实验
       2.5.1  同板精密度实验  在硅胶G薄层板上点供试品溶液3 μl，点5个点，按上述条件展开，显色，分别测定各斑点的积分值。结果见表2。
       2.5.2  异板精密度实验  取5张硅胶G薄层板，分别点供试品溶液3 μl，按上述条件展开，显色，分别测定各板上斑点的积分值。实验结果见表3。
       表2  同板精密度实验结果（略）
       表3  异板精密度实验结果（略）
       结果表明，方法的精密度良好。
       2.6   稳定性实验 将以上精密度实验的斑点分别于0，2，4，6，8 h进行扫描测定。结果见表4。结果表明，在6 h内的积分值基本稳定。
       表4  稳定性实验结果（略）
       2.7  重复性实验 取同一批号（20041112）乌达巴拉-7供试品5份，每份取样量约0.4 g，精密称定，分别按“溶液的制备”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液。吸取供试品溶液3 μl，对照品溶液1 μl和3 μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以异辛烷醋酸乙酯冰醋酸甲酸（8∶4∶2∶1）为展开剂，取出，晾干，喷10%的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰。照薄层扫描法［2］进行扫描，波长为λs=470 nm，λR=650 nm。测量供试品与标准品的吸收度积分值，计算，即得。结果见表5。
       表5  重复性实验结果（略）
       2.8   加样回收实验 取已知胆酸含量的乌达巴拉-7（批号为20041112）6份，每份约0.2 g，精密称定，分别精密加入胆酸对照品适量，按质量标准“2.7”项下方法操作并测定每份的含量，计算回收率，结果平均回收率为 99.08%，RSD为 0.909%。结果见表6。
       表6  加样回收实验结果（略）
       2.9  阴性对照实验   取按处方量并以相同工艺制备的阴性对照品（缺牛黄），按质量标准“2.7”项下方法操作，对胆酸相对应的位置进行光谱扫描。结果表明，阴性对照对测定无干扰。薄层扫描图见图3。
       图3  阴性对照实验（略）
       2.10  样品含量测定 取本品按质量标准“2.7”项下的方法操作并测定。结果见表7。
       表7  样品中胆酸的含量测定结果（略）
       3  讨论
       3.1  展开条件的选择本品为复方制剂，共存成分对测定有干扰, 因此，对薄层展开剂作了筛选。文献记载，在测定胆酸的过程中，采用的展开系统有异辛烷－醋酸乙酯-冰醋酸（15∶7∶5）、异辛烷－醋酸乙酯-冰醋酸-甲酸（8∶4∶2∶1）［3］、氯仿－醋酸乙酯-甲醇-水（4∶3∶2∶1）［4］，正己烷-醋酸乙酯-乙酸-甲醇(20:25:2:3)上层［4］，异辛烷－醋酸丁酯-冰醋酸-甲酸（8∶4∶2：1）［6］。经筛选认为，异辛烷－醋酸乙酯-冰醋酸-甲酸（8∶4∶2∶1）为展开剂时展开效果最佳，且阴性对照对测定无干扰。
       3.2  显色条件的选择在试验过程中，采用不同浓度的硫酸乙醇液（50%，30%，10%硫酸乙醇液）作为显色剂，并对结果进行比较研究。结果表明，当硫酸浓度高时，斑点最初显色的色泽较好（粉红）,但显色点不易掌握，薄层板及其胆酸斑点均易炭化；当硫酸浓度低时，斑点显色的色泽为紫红色，但显色重复性好，故确定以10%硫酸乙醇液作为显色剂。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册［S］.199：160.
       
       ［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录ⅥB.
       
       ［3］ 傅 军， 周 漩， 高晓霞，等. 薄层扫描法测定珍黄液中胆酸的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12（3）：25.
       
       ［4］ 荀雅书，陶苏和，王梦德. 薄层扫描测定法测定蒙成药中胆酸的含量［J］.中国民族医药杂志，1999，5（3）：40.
       
       ［5］ 顾艳丽，周雪梅， 韩瑞兰. 薄层扫描法测定图喜木勒-3中人工牛黄胆酸及猪去氧胆酸的含量［J］.中国民族医药杂志，2006，13（3）：53.
       
       ［6］ 王青虎， 梁健存， 武晓兰，等. 薄层扫描法测定西红花十六味丸的质量标准研究［J］.中成药，2006，28（11）：1694.