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       【摘要】 
       目的观察参芪复方对自发性2型糖尿病动物GK大鼠（Goto-Kakizaki wister rats）胰岛β细胞凋亡的影响及其可能机制。方法选取4月龄SPF级雄性GK大鼠50只，随机分为模型组、盐酸二甲双胍组、参芪复方低、高剂量组并另设正常Wister大鼠对照组。连续灌药4周后，TUNEL染色观察各组胰岛β细胞凋亡指数（AI），并采用免疫组化染色，Mias-2000图像分析系统观察各组大鼠胰岛β细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）阳性物质积分光密度。结果模型及低剂量组β细胞AI较正常组显著增高（P<0.01），各治疗组AI显著低于模型组（P<0.01），高剂量及二甲双胍组β细胞AI显著降于低剂量组（P<0.01）且与正常组比较无统计学意义（P＞0.05）；模型及低剂量组胰岛iNOS阳性物质积分光密度显著高于正常组（P<0.01），高剂量组、二甲双胍组iNOS积分光密度显著低于模型组（P<0.05），与正常组比较无统计学意义（P＞0.05）。结论参芪复方能够抑制GK大鼠胰岛β细胞凋亡，机制可能与其抑制β细胞iNOS表达有关。
       【关键词】  参芪复方 GK大鼠 β细胞 诱导型一氧化氮合酶 凋亡
       参芪复方主要由人参、黄芪、山药、山茱萸、生地、天花粉、丹参、制大黄等组成，具有益气养阴、清热生津，活血化淤的功效。以往研究显示，参芪复方具有抗2型糖尿病（T2DM）早期动脉粥样硬化、低度炎症的作用［1,2］，但其对胰岛β细胞凋亡的影响未见报道。本研究观察了参芪复方对自发性2型糖尿病动物模型GK大鼠胰岛β细胞凋亡的影响并初步探讨了其可能机制。
       1  器材
       1.1   动物4月龄雄性SPF级自发性2型糖尿病GK大鼠50只及正常Wistar大鼠16 只（中国科学院上海实验动物中心提供），按2～3只/笼饲养于独立通气笼具（IVC）系统内。
       1.2   药品与试剂参芪复方浸膏粉（1g浸膏粉相当于原生药10g，四川大学华西药学院药厂提供，批号20031008），盐酸二甲双胍片（天津太平洋制药有限公司，批号：20040523），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（博士德公司），诱导型一氧化氮合酶（iNOS）一抗、即用型SABC试剂盒（博士德公司）。
       1.3   仪器Mias-2000图象分析系统（四川大学智胜软件股份有限公司），OLYMPUS BX50型光学显微镜（日本OLYMPUS公司）等。
       2  方法
       2.1  分组方法GK大鼠适应性饲养1周后，尾静脉取血测随机血糖，随机血糖≤11.1 mmol/L者共6只剔除［3］，余44只按血糖由高到低排列编号依据随机分为模型组、二甲双胍组、中药低剂量组、中药高剂量组，另设普通Wistar大鼠正常对照组，每组11只。各组均喂饲普通饲料。
       2.2  给药方法正常对照组和模型组予生理盐水5ml/（kg·d）灌服；二甲双胍组予盐酸二甲双胍125.0 mg/（kg·d），中药低、高剂量组分别予参芪复方0.5，2.0 g/（kg·d），共28 d。
       2.3  观察指标及检测方法
       2.3.1  β细胞凋亡计数  大鼠处死后立即取鼠胰腺组织，应用TUNEL法染凋亡细胞，试剂盒购于博士德公司，操作按试剂盒说明进行。光镜下观察凋亡细胞核呈紫蓝色，胞浆呈棕黄色颗粒。每例切片计数10个400倍视野的凋亡细胞数，然后按公式计算细胞凋亡指数（AI）。AI（%）＝凋亡细胞数/总细胞数×100%。
       2.3.2  胰岛iNOS表达大鼠处死后立即取鼠胰腺组织，FFA液（甲醛醋酸酒精固定液）固定后，石蜡包埋，滚动式切片机纵切成4μm薄片，将切片置于经防脱片剂处理后的载玻片上，使切片紧密黏附，常规脱蜡至水化，余参照即用型SABC免疫组化试剂盒说明书染色。用OLYMPUS BX50光学显微镜观察染色结果，胞浆棕染为阳性，每张切片选3个胰岛，输入Mias-2000图像分析系统，在200×镜下分别测量胰岛细胞iNOS阳性物质积分光密度并计算其均值。
       2.4  统计方法用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD，方差不齐采用Tamhanecs"T2统计方法。
       3  结果
       3.1   一般状况实验过程中模型组3只大鼠、低剂量组和二甲双胍组各1只大鼠死亡。其余各组大鼠无死亡。
       3.2  参芪复方对各组大鼠胰岛β细胞凋亡指数的影响见表1。模型组及低剂量组较正常组凋亡指数显著增高（P<0.01），高剂量组及二甲双胍组凋亡指数虽较正常组升高，但差异无显著性(P>0.05)；各治疗组凋亡指数较模型组显著降低（P<0.01）；高剂量组及二甲双胍组凋亡指数较低剂量组显著降低（P<0.01）。
       表1  参芪复方对各组大鼠胰岛凋亡指数影响比较（略）
       与正常组比较，＃＃P<0.01；与模型组比较，※※P<0.01；与低剂量组比较，▲▲P<0.01
       3.3   参芪复方对各组大鼠胰岛β细胞iNOS表达影响见表2。模型组与低剂量组iNOS积分光密度较正常组显著增高（P<0.01），高剂量组及二甲双胍组积分光密度虽较正常组增高但差异无显著性（P>0.05）；高剂量组及二甲双胍组积分光密度较模型组显著下降（P<0.05，0.01），低剂量组与模型组积分光密度差异无显著性（P>0.05）；各治疗组积分光密度差异无显著性（P>0.05）。
       表2  参芪复方对各组大鼠胰岛β细胞iNOS表达影响比较（略）
       与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，※P<0.05，※※P<0.01
       4  讨论
          
       GK大鼠为国际公认的自发性非肥胖性2型糖尿病动物模型，由Goto等1975年通过对Wistar大鼠进行口服葡萄糖耐量试验并筛选高血糖的个体进行培育而来，比目前普遍使用的饮食诱导胰岛素抵抗加化学损伤胰岛β细胞的动物模型更符合T2DM 的病理生理，主要表现为胰岛素分泌不足、葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损，β细胞数目减少，肝糖生成过多，肌肉和脂肪组织中度胰岛素抵抗等典型2型糖尿病特征，在长期糖尿病之后，易患有各种并发症［4］，为研究2型糖尿病的一种较好的动物模型。
       
       细胞凋亡（apoptosis）是由局部环境生理或病理性变化引起的、自身内部机制调节的一种主动的、按一定程序进行的细胞自发性死亡，它涉及一系列的基因激活表达及调控，是生物界重要的生命现象之一。过去认为胰岛素抵抗在2型糖尿病病理生理机制中占主要位置，但近年研究表明，无论是肥胖还是非肥胖的2型糖尿病患者，与其体重指数相当的非糖尿病人群相比，其胰岛β细胞数目明显减少，胰岛β细胞凋亡发生率明显高于正常人群，而两组人群间胰岛再生和分化过程并无明显区别。这个结果高度提示胰岛β细胞凋亡数目减少在2型糖尿病患者胰岛功能衰竭中发挥了举足轻重的作用［5］。延缓和（或）防止胰岛β细胞凋亡已成为糖尿病治疗的一个重要方向。本研究证实参芪复方能显著抑制GK大鼠胰岛β细胞凋亡，提示降糖作用不及西药的中药复方可能通过干预胰岛β细胞凋亡这一重要环节治疗2型糖尿病。
       
       NO是一种重要的内源性生物信使分子，由左旋精氨酸(L-Arg)在NO合酶(NOS)的作用下生成。在基因水平NOS分为神经型NOS (nNOS )、内皮型NOS (eNOS)和诱导型NOS(iNOS) 3 种［6］。nNOS 和eNOS主要存在于神经细胞和内皮细胞，其合成NO量少，起传递生物信息的作用，而iNOS是在诱生因素作用下，由巨噬细胞、中性粒细胞、胰岛细胞等产生，其活性不受Ca2+浓度的影响，其催化产生的NO量大，具有细胞毒性作用［7］，能直接诱导细胞凋亡［8，9］。本研究证实参芪复方可显著减少GK大鼠胰岛β细胞iNOS的表达，以中药高剂量组作用最明显（P<0.01）。因此，我们认为降低胰岛β细胞iNOS表达，减少NO生成，抑制NO诱导的胰岛β细胞凋亡，可能为参芪复方抗胰岛β细胞凋亡的机制之一。
       
       总之，本研究初步证实具有益气养阴、活血化淤之功效的参芪复方可明显改善GK大鼠胰岛β细胞凋亡，保护胰岛β细胞，其机制可能与抑制胰岛β细胞iNOS表达有关。
       【参考文献】
         　　［1］ 张红敏,陈世伟,谢春光,等.参芪复方抗自发性糖尿病GK大鼠早期动脉粥样硬化的作用机制［J］.中国中药杂志,2006,31(15)：1272.
       
       ［2］ 张红敏,陈世伟,谢春光，等.参芪复方对GK大鼠炎症标志物的影响及机理探讨［J］.中药材,2006,29(3)： 249.
       
       ［3］ 黄 松.糖尿病动物模型研究现状及进展［J］.广西医学, 2002, 24(1)：46.
       
       ［4］ Picarel-Blanchot F, Berthelier C, Builbe D, et al. Imparied insulin secretion and excessive hepativ glucose production are both early events in the diabetic GK rat［J］. Am J Physio1, 1996, 271(4pt1)：E755.
       
       ［5］ Butler AB，Janson J, Bonner Weir S et al. Beta-cell deficit and in-creased beta cell apoptosis in humans with type 2 diabetes［J］.Diabetes, 2003, 52(l)：102.
       
       ［6］ 高 博,尹桂山.神经系统中的一氧化氮［J］.生物化学与生物物理进展,1999,26(1)：31.
       
       ［7］ Nathan C, Me QW. Regulation of biosynthesis of nitric oxide［J］. JBiol Chem,1994, 269(19):13725
       
       ［8］ K Fehsel, KD Kroncke, KL Meyer et al.Nitric oxide induces apoptosis in mouse thymocytes［J］.The Journal of Immunology, 1995, 155(6)：2858.
       
       ［9］ Geng YJ, Hellstrand K, Wennmalm A, Hansson GK.Apoptotic death of human leukemic cells induced by vascular cells expressing nitric oxide synthase in response to gamma-interferon and tumor necrosis factoralpha［J］.Cancer Res,1996,56(4)：866.