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       【摘要】 
       目的建立快速、高效测定蝉花ＩＳＰ 类免疫活性组分含量的方法。方法采用茚三酮比色法测定ＩＳＰ 类次生代谢产物的含量，通过线性度和线性范围、精密度、稳定性及准确度等指标评价该方法。结果该方法检测线性范围为６ ～３０μｇ／ｍｌ，相关系数为０．９９９ ７，平均回收率为１０１．２０％，RSD为０．７９％。结论茚三酮比色法简便快捷、结果稳定、灵敏度高，可作为测定蝉花ＩＳＰ 类免疫活性组分的有效方法。
       【关键词】  蝉花 ＩＳＰ 比色法
       Research on the Content Determination of ISP －like Immunoregulational Ingredient in Cordyceps Cicadae
       YANG Mingjing, WANG Bochu, YU Jiawen, MAO Xianbing, ZHU Huali
       (College of Bioengineering， Chongqing University， Chongqing ４０００３０， China； Chongqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing ４０００６５， China)
       Abstract：ObjectiveＴｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ for determination of ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＩＳＰ －ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ C．cicadae．MethodsＴｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＩＳＰ －ｌｉｋｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ．Ｔｈｅ ｖａｌｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｖｅｒａｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｍｅ ｉｎｄｅｘｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ａｎｄ ｒａｎｇｅ ， ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ， ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ．ResultsＴｈｅ linear ｒａｎｇｅ ｗａｓ ６ ～３０ μｇ／ｍｌ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ０．９９９７， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｗａｓ １０１．２０％， ａｎｄ RSD ｗａｓ ０．７９％．ConclusionＴｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ， ｒａｐｉｄ， ａｃｃｕｒａｔｅ， ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ. It can be used for the ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ of the ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＩＳＰ －ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ C．cicadae．
       Key words：Cordyceps cicadae；  ＩＳＰ；   Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ
       
       蝉花是我国传统的一种名贵中药，与冬虫夏草一样同属虫菌复合体，且含有相近的化学成分，医家常将其用作冬虫夏草的代用品。医学研究表明，它具有显著的免疫调节、抗疲劳和改善肾功能的作用［１］ 。而有关蝉花药理物质基础的报道仍然较少［２］ 。Ｆｕｊｉｔａ 等［３］ 通过细胞模型从蝉花培养滤液中筛选得到的免疫活性成分ＩＳＰ －１，具有显著的双向免疫调节作用，免疫抑制力比环孢菌素Ａ 更强且副作用小［３，４］ 。由于蝉花ＩＳＰ 类次生代谢产物含量较低，难以检测，目前尚未见定量测定其含量的报道。基于ＩＳＰ 类物质为长脂链α－氨基酸，与茚三酮共热时生成蓝紫色的酮茚胺，在一定范围内吸光度和氨基酸含量成正比［５］ ，本研究采用茚三酮比色法定量测定蝉花ＩＳＰ 类物质的含量，建立起一种快捷有效测定ＩＳＰ 类物质的方法。
       1  器材与方法
       1.1  仪器与试剂ＵＶ －１６０１ 紫外可见光分光光度计（日本ＳＨＩＭＡＤＺＵ）；ＪＡ１００３Ａ 电子天平（上海精天电子仪器厂）；２０１ 型升降恒温水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；ＮＫＡ 非极性大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂）；６２３０Ｍ 型ｐＨ 酸度计（上海洪纪仪器设备有限公司）；Ｌ －丝氨酸（上海康达氨基酸厂）；茚三酮（上海三爱思试剂有限公司）。其余试剂均为分析纯，水为去离子水。
       1.2  方法
       1.2.1  样品溶液制备蝉花菌培养滤液２ Ｌ 上大孔吸附树脂ＮＫＡ 柱，柱高２３ ｃｍ，内径２．８ ｃｍ。分别用水２ Ｌ，５０％乙醇２ Ｌ洗柱，直至流出液无色，流出液弃之，再用１ Ｌ 乙醇洗脱，收集流分，减压浓缩至干，１０ ｍｌ 甲醇溶解。进行比色测定时，取１ ｍｌ 甲醇溶液乙二醇甲醚稀释５０ 倍。
       1.2.2  比色测定方法参见文献［６］，略作改进。准确称量丝氨酸３．０ ｍｇ，用水湿润溶解后转入１００ ｍｌ 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得３０ μｇ／ｍｌ 丝氨酸对照溶液。吸取一定量丝氨酸对照溶液或样品溶液于２０ ｍｌ 具塞刻度试管中，不足１．０ ｍｌ 则用水补足，依次加入１．０ ｍｌ 醋酸－乙酸钠缓冲溶液（ｐＨ５．４），１．０ ｍｌ １％茚三酮乙二醇甲醚溶液，０．１ ｍｌ ０．１％抗坏血酸溶液，摇匀，盖上塞，于９０℃水浴加热３０ ｍｉｎ，取出冷水冷却１５ ｍｉｎ，加入３ ｍｌ ６０％乙醇稀释，摇匀，以试剂空白为参比，在５６７ ｎｍ 处测量其吸光度Ａ５６７ｎｍ 。
       1.2.3  薄层检测准确称量丝氨酸３．０ ｍｇ，加入２ ｍｌ 水溶解作为薄层点样液。吸取上述点样液５ μｌ，样品甲醇溶液４０ μｌ，分别点于同一硅胶ＧＦ２５４ －ＣＭＣＮａ 薄层板上，０．２％茚三酮－乙醇溶液喷雾，１１０℃加热显色。再吸取样品甲醇溶液４０ μｌ，蝉花发酵液１０ 倍浓缩液４０ μｌ 分别点于之前同一薄层板上，以氯仿－甲醇－水（６５∶３０∶５）为展开剂展开，取出晾干，０．２％茚三酮－乙醇溶液喷雾，１１０℃加热显色。
       2  结果与讨论
       2.1  最大吸收波长的确定分光光度法测定物质含量时，首先须确定反应体系的最大吸收波长。分别精密吸取样品溶液、丝氨酸对照溶液和水１．０ ｍｌ，按方法“１．２．２”项，以水为参比于３００ ～６００ ｎｍ 波长下进行全波长扫描，结果如图１ 所示。可见样品溶液反应产物在５６７ ｎｍ 处有最大吸光度，与对照品丝氨酸反应产物扫描结果相同（结果未给出），与文献报道氨基酸反应产物扫描结果一致［７］ ；空白液在４５０ ｎｍ 以后基本无吸收。由此确定５６７ ｎｍ 为测定波长。
       2.2  反应温度和反应时间的确定精密吸取丝氨酸对照溶液１．０ ｍｌ，按方法“１．２．２”，分别于９０，８０，７０℃水浴加热不同时间，测定A５６７ ｎｍ ，结果见图２。可见，随着反应时间的增加，A 值随之增大，随后趋于稳定。在９０℃下反应３０ ｍｉｎ，A 值达到最大。再增加反应时间，Ａ 值无明显变化。而在７０，８０℃条件下，反应完全的时间均因温度低而延长。同时对样品进行了考察，结果如图２ 所示。可见，样品在９０℃下３０ ｍｉｎ 后反应也已完全。因此，确定反应温度为９０℃，反应时间为３０ ｍｉｎ。
       图１  反应产物和空白的扫描图（略）
       图２  反应时间和反应温度与吸光度的关系（略）
       2.3  标准曲线的绘制精密吸取丝氨酸对照溶液０．２，０．４，０．６，０．８ 和１．０ ｍｌ，按照方法“１．２．２”项测定A５６７ｎｍ 。以丝氨酸含量为横坐标，A 为纵坐标，绘制标准曲线如图３。结果表明，丝氨酸浓度在６ ～３０ μｇ／ｍｌ 范围内与吸光度Ａ５６７ ｎｍ 呈良好的线性关系。
       图３  丝氨酸标准曲线（略）
       2.4  精密度和稳定性实验精密吸取样品溶液１．０ ｍｌ，按方法“１．２．２”项，连续测定A５６７ ｎｍ ５ 次，分别为０．９０１ ９，０．９０１ ６，０．９０１５，０．９０１ ３和０．９０１ １。求得相对标准偏差RSD为０．３０％，说明本方法精密度良好。
        精密吸取样品溶液１．０ ｍｌ，按方法“１．２．２”项，反应后放置０．５，１，１．５，２ ｈ 测定A５６７ ｎｍ ，分别为０．９０１ ９，０．８９８ ２，０．８９３ ５，０．８８７ ９。求得RSD为０．６７％。可见显色反应在２ ｈ 内无明显褪色，说明本方法稳定性良好。
       2.5  重现性实验在进行样品检测时，不仅要求方法具有较高的灵敏度和精密度，而且还要有很高的重现性。精密吸取５ 份样品溶液各１．０ ｍｌ，按照方法“１．２．２”项，测定Ａ５６７ ｎｍ ，分别为０．９０１９，０．９０３ ３，０．９０２ ８，０．９０５ ６ 和０．８９６ ６，求得RSD为０．３７％，说明本方法重现性良好。
       2.6  回收率实验为了确定该方法的准确度，进行了加样回收率实验。精密吸取样品溶液０．２ ｍｌ 按方法“１．２．２”项进行比色测定，测得值为本底量。然后分别加入丝氨酸对照溶液０．２，０．４，０．６ ｍｌ，测定A５６７ｎｍ ，得加样后的总量，计算平均回收率和RSD，得加样回收率实验结果，见表１，可见本方法准确度良好。
       表1  加样回收率实验结果（略）
       2.7  样品测定分析精密吸取样品溶液１．０ ｍｌ，按方法“１．２．２”项测得其A５６７ ｎｍ为０．９０１ ９。对应标准曲线并计算得发酵液滤液ＩＳＰ 类物质浓度为１５．７９ ｍｇ／Ｌ。同时，测定了菌丝体ＩＳＰ 类物质的浓度。精密称量蝉花菌丝体１５．０ ｇ，乙醇回流３ 次，过滤得乙醇提取液１∶１ 水稀释，按方法“１．２．１”项，得菌丝体乙二醇甲醚溶液，精密吸取上述溶液１．０ ｍｌ，按方法“１．２．２”项测得其Ａ５６７ ｎｍ 为０．７０２ ６。而每升发酵液可获得菌丝体１０ ｇ，对应标准曲线并计算得菌丝体ＩＳＰ 类物质浓度为１６．４６ ｍｇ／Ｌ。合计每升发酵液ＩＳＰ 类物质浓度为３２．２５ ｍｇ／Ｌ。可见，蝉花中ＩＳＰ 类次生代谢产物的含量较低，仍然有待通过菌种选育和优化发酵条件提高其产量。
       2.8  测定方法的评价蝉花中ＩＳＰ 类次生代谢产物含量低，难以检测。笔者采用茚三酮比色法对蝉花ＩＳＰ 类物质含量的测定进行了研究。在建立测定方法时，为了排除其他类氨基酸对测定的干扰，按方法“１．２．３”项进行了薄层层析检测，结果如图４ 所示。可见，丝氨酸对照品和样品经茚三酮显色后，均生成红紫色物质，薄层展开后具有相同的Ｒｆ 值。发酵液中含有大量极性较大的物质，在薄层上显示为靠近原点处的紫红色带。而经过分离的样品仅接近前沿有红色斑点，排除了样品中有其他极性氨基酸物质的干扰。通过ＨＰＬＣ －ＭＳ 鉴定样品主要成分之一为ＩＳＰ －１（结果另文报道），表明样品中显色的为ＩＳＰ 类弱极性物质，为茚三酮比色法测定ＩＳＰ 类物质提供了依据，从而确保该法测定样品中ＩＳＰ 类物质的准确性。
       图４  薄层层析色谱图（略）
       
       笔者对本方法反应体系进行了合理优化，选用乙二醇甲醚对样品甲醇溶液进行稀释，其作为茚三酮的溶剂，稀释样品甲醇溶液的同时可以保持溶液的澄清，且沸点较高，反应过程中不会逸出破坏反应体系。同时，考察了定量分析方法认证的参数，如线性度和范围、精密度、准确度、稳定性及重复性等。实验结果表明，茚三酮比色法简单快速，精密度高，准确度好，可作为蝉花中ＩＳＰ 类免疫调节活性物质含量测定的有效方法，对于进一步优化ＩＳＰ 的生产工艺和研究其药理作用均具有重要的意义。
       【参考文献】
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