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       【摘要】 
       目的探讨大豆苷元对神经母细胞瘤ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞凋亡和增殖的影响。方法采用细胞生长抑制实验（ＭＴＴ法）、流式细胞仪检测等方法观察ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞的形态变化、细胞凋亡率及细胞周期变化。结果１０．０ ～８０．０ μｇ／ｍｌ 的大豆苷元明显抑制细胞的增殖，且有剂量依赖性；与对照组相比，大豆苷元处理２４ ｈ 后，各组ＳＨ－ＳＹ５Ｙ 细胞均出现亚二倍体峰（Ｓｕｂ－Ｇ１ ），细胞凋亡率与大豆苷元呈剂量依赖性。结论大豆苷元可诱导神经母细胞瘤ＳＨ－ＳＹ５Ｙ 细胞凋亡，对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ 细胞增殖有明显的抑制作用。
       【关键词】  神经母细胞瘤 大豆苷元 增殖
       The Inhibitory Effect of Daidzein on the Proliferation of Neuroblastoma Cells
       ＸＵ Ｙｉｎｇ， ＺＨＵ Ｈｅｎｇｙｉｎｇ，ＬＩ Ｓｈｕｍｅｉ，ＬＡＩ Ｒｉｙｏｎｇ， ＴＡＮＧ Ｄａｎ
       （Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi ３４１０００，China； Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Ganzhou, Jingxi ３４１０００，China）
       Abstract：ObjectiveＴｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｄａｉｄｚｅｉｎ ｏｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ．MethodsＴｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ａｓｓａｙ.Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ．Results１０．０ ～８０．０ μｇ／ｍｌ ｏｆ Ｄａｉｄｚｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎ ｈｉｂｉｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＨ －ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌ， Ｄａｉｄｚｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＳＨ －ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ was ｉｎ ｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓe ｏｆ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ．ConclusionＤａｉｄｚｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔ ｃan ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＨ －ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌ．
       Key words：Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ；   Ｄａｉｄｚｅｉｎ；   Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
       
       神经母细胞瘤（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ， ＮＢ）是儿童较常见的恶性肿瘤，发病率占儿童恶性肿瘤的第３ 位，与儿童期常见的其他恶性肿瘤相比，化疗效果差，严重威胁儿童的生命安全。因此，寻找新的治疗药物成为人们十分关切的问题。近年来，多种研究发现大豆异黄酮对多种癌症具有抑制和治疗作用［１］ ，但对大豆异黄酮抗癌作用的研究主要集中在乳腺癌和前列腺癌等激素依赖性肿瘤，关于其对儿童神经母细胞瘤生长作用的影响研究报道很少。因此，我们于体外观察了大豆苷元对ＮＢ 细胞株ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 生长的影响，以期为进一步研究其作用机制及临床应用提供实验室依据。
       １  材料与方法
       １．１  材料ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞株为贵阳医学院分子生物学重点实验室赠送。大豆苷元（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）为陕西赛德高科生物股份有限公司馈赠，纯度为９８％。ＲＰＭＩ －１６４０ 为Ｇｉｂｃｏ 公司生产，小牛血清为杭州四季青公司生产，二甲基哑砜（ＤＭＳＯ）和噻唑蓝（ＭＴＴ）为Ｓｉｇｍａ 公司生产。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ 流式细胞仪为美国ＢＤ 公司生产；ＭＫ３ 型酶标仪和３１１１ 型ＣＯ２ 培养箱均为美国Ｔｈｅｒｍｏ 公司生产。
       １．２   方法
       １．２．１  细胞培养与接种ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞株培养在含５％小牛血清的ＲＰＭＩ －１６４０ 培养基中，ＣＯ２ 培养箱内（５％），恒温３７℃。当细胞长满时，用０．２５％胰蛋白酶消化，收集细胞，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ，离心５ ｍｉｎ，ＰＢＳ 洗２ 次，以１ ～２ ×１０４ 的浓度接种于９６ 孔板内，每孔体积为１８０ ｍｌ。
       １．２．２  受试药物的处理将大豆苷元溶解在ＤＭＳＯ 中，配成１００ｍｇ／ｍｌ 的储存液， －２０℃保存。使用时用完全培养基将其稀释成１０ ｍｇ／ｍｌ 的工作液，用直径为０．２２ μｍ 的微孔滤膜过滤除菌置于４℃保存，并进一步用完全培养基分别稀释成所需的不同浓度，待细胞接种２４ ｈ 后分别加入不同浓度的受试药，每孔２０ μｌ，使其终浓度分别为０．１，１．０ ，１０．０，２０．０，４０．０ ，６０．０ ，８０．０，１００．０，１５０．０ ｍｇ／ｍｌ。每个浓度为４ 个孔，同时用含ＤＭＳＯ 的完全培养基和空白一起作对照。ＭＴＴ 用ＰＢＳ（ｐＨ ８．２）配成５．０ｍｇ／ｍｌ 的溶液，磁力搅拌器搅拌３０ ｍｉｎ，直径为０．２２ μｍ 的微孔滤膜过滤除菌后４℃保存，２ 周内有效。
       １．２．３  细胞生长抑制效应的测定采用ＭＴＴ 比色法［２］ 。细胞接种２４ ｈ 后加受试药，之后每隔２４ ｈ 用ＭＴＴ 比色法测定光密度值，即对应的活细胞数。具体操作如下：加受试药后每隔一定时间加ＭＴＴ 溶液１０ μｌ，３７℃继续培养４ ｈ，终止培养后小心吸去孔内培养上清液，每孔加入１５０ μｌ ＤＭＳＯ，振荡器振荡５ ～１０ ｍｉｎ，使结晶物充分溶解。选择４９０ ｎｍ 波长在酶联免疫检测仪上测各孔的光吸收值，记录大豆苷元作用于ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞的浓度效应数据和时间效应数据，用下列公式计算药物对细胞生长的抑制率，并绘制效应曲线。
       
       抑制率（％）＝对照孔测定的平均OD 值－加药组测定的平均OD 值照孔测定的平均OD 值×１００%
       表1  大豆苷元对SH-SY5Y细胞增殖抑制率的影响（略）
       与对照组比较，★P＜0.05；n=3
       １．２．４  流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分析各组细胞培养４８ ｈ 后，收集各组细胞悬液１ ｍｌ，浓度约为１０６ 个／ｍｌ，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，弃掉培养液，用ＰＢＳ 离心冲洗两次，以７０％的冷乙醇固定，４℃保存１ ～２４ ｈ，１  ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ 后，ＰＢＳ 洗涤冲洗去乙醇２ 次；加入ＲＮａｓｅ Ａ（终浓度为６０ μｇ／ｍｌ），摇匀，３７℃温育３０ ｍｉｎ；加入ＰＩ（终浓度为５０μｇ／ｍｌ）染料１ ｍｌ，４℃暗染３０ｍｉｎ。流式细胞仪检测，每份标本测定（４ ～８） ×１０３ 个细胞，采用ＭｏｕｆｉｔＬＴ 软件对各组样本进行ＤＮＡ 含量及细胞周期分析。
       １．３  统计学方法实验均重复３ 次以上。所有的测定指标均采用±s表示，用ＳＰＳＳ １４．０ 统计软件包进行分析，凋亡实验用方差分析，细胞增殖实验用t检验。以P ﹤ ０．０５ 表示差异有显著性。
       ２  结果
       ２．１  大豆苷元对ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞的生长抑制作用细胞增殖抑制实验结果显示，与正常对照组相比，大豆苷元各浓度组处理２４～７２ ｈ 的细胞抑制率与正常对照组比较均有显著性升高（P＜０．０５）（表１，图１）。大豆苷元处理ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞２４，４８，７２ ｈ的ＩＣ５０ 分别是６５．０，４７．０，４０．０ μｇ／ｍｌ。以上结果表明大豆苷元对ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞的体外增殖具有较强的抑制作用，其抑制作用在一定的范围内有剂量和时间依赖性，并呈现出一定的饱和性。
       图1  大豆苷元对SH-SY5Y细胞体外增殖的抑制作用（略）
       ２．２  　大豆苷元对ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞周期和凋亡的影响药物处理４８ ｈ 后，大豆苷元各浓度组均能诱导Ｈ －ＳＹ５Ｙ 细胞凋亡，Ｇ１ 峰前出现亚二倍体峰（Ｓｕｂ －Ｇ１ ），即凋亡细胞所特有的凋亡峰（图２）。大豆苷元诱导ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞凋亡呈现一定的剂量依赖性，细胞凋亡率显著高于正常对照组（P ＜０．０５）。随着大豆苷元浓度的升高，Ｇ０ ／Ｇ１ 和Ｇ２ ／Ｍ 期的细胞明显减少，ＤＮＡ 合成期（Ｓ期）细胞数均明显增多，表明大豆苷元使ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞发生Ｓ期阻滞，抑制细胞增殖。
       图2   大豆苷元对SH-SY5Y细胞周期和凋亡的影响（略）
       ３  　讨论
          
       ＮＢ 治疗十分棘手，人们一直在积极寻找新的治疗药物。我国中医中药用于治疗肿瘤历史悠久，具有疗效确切、毒副作用低等优点。大豆异黄酮是重要的植物化学物质，由１２ 种单体组成，包括金雀异黄素、大豆苷元、黄豆黄素３ 种苷元及这３ 种苷元衍生的９ 种苷类成分。大量研究表明［３，４］ 大豆异黄酮类化合物在高浓度时具有防癌抑癌作用。近年来，从细胞凋亡角度探讨中草药抗肿瘤作用机制及从天然药物中筛选抗癌药物已成为研究热点。本研究采用ＭＴＴ 法和流式细胞仪检测了大豆苷元对ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。
       
       细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。ＭＴ 结果也表明大豆苷元对ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞的体外增殖具有明显的抑制作用，在１０ ～８０ μｇ／ｍｌ 的范围内其抑制作用随药物浓度的增加及作用时间的延长其抑制作用更加明显；当浓度大于８０ μｇ／ｍｌ 后，其抑制作用不再随药物浓度增加和作用时间延长而进一步增强，呈现出一定的饱和性。流式细胞仪检测结果显示大豆苷元能诱导ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞凋亡，且随大豆苷元浓度的升高，Ｇ０ ／Ｇ１ ＨＥＧ２ ／Ｍ 期的细胞数明显减少，ＤＮＡ 合成期（Ｓ 期）明显增多，提示大豆苷元可使ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞发生Ｓ 期阻滞，从而抑制细胞增殖。目前对于大豆异黄酮类物质抑制细胞增殖的机理研究认为它抑制细胞增殖的主要包括性激素样作用、抗氧化作用、诱导细胞凋亡的作用、抑制酪氨酸蛋白激酶的活性和抑制拓扑异构酶的活性等［５ ～８］ 。我们研究表明大豆苷元能通过使ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞发生Ｓ 期阻滞来抑制ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞的增殖。是否还存在其他途径抑制ＳＨ－ＳＹ５Ｙ 细胞的增殖，在本实验中没有涉及，尚不得而知。
       
       总之，本研究表明大豆苷元在体外对ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞的增殖有明显的抑制作用并能诱导细胞凋亡，尽管目前对其是通过激活细胞凋亡的那条途径来诱导ＳＨ －ＳＹ５Ｙ 细胞凋亡尚不得而知，有待进一步研究，但本研究还是可以为ＮＢ 的治疗提供一种新思路。
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