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       【摘要】 
       目的研究淡豆豉防治早期动脉粥样硬化大鼠血管损伤的机制。方法采用高脂饲料喂养法建立大鼠早期动脉粥样硬化模型，同时灌胃给予淡豆豉提取物，连续10周，末次给药后取血、分离血清全自动生化分析仪检测TC，TG，LDL，HDL水平，透射电镜下观察主动脉损伤的形态学变化，流式细胞仪检测主动脉内皮细胞的凋亡率、Caspase-3的蛋白表达和增殖指数。结果淡豆豉组（20，40 g生药/kg）大鼠血清TC，TG，LDL水平均较模型对照组大鼠降低（P<0.01），主动脉内皮细胞的形态明显较模型对照组改善，内皮细胞的凋亡率、Caspase-3的蛋白表达均显著降低（P<0.01），而增殖指数显著增高(P<0.01)。结论淡豆豉对早期动脉粥样硬化大鼠血管损伤有明显的保护作用，其机制可能通过下调Caspase-3的蛋白表达，调节血管内皮细胞凋亡与增殖的平衡来实现。
       【关键词】  淡豆豉 早期动脉粥样硬化 血管损伤 Caspase-3蛋白
       淡豆豉Semen Sojae Preparatum (SSP)是由豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的成熟种子和青蒿、桑叶等中药经发酵加工而成，其中的主要成分大豆异黄酮具有广泛的生物学活性，研究资料显示大豆异黄酮的植物雌激素作用，可以降低人体多种雌激素依赖型疾病的发病率。据此思路,我们早期的研究发现淡豆豉对去卵巢大鼠脂代谢紊乱有明显的调整作用，对心血管系统具有保护作用［1～3］。本实验采用高脂饲料喂养法建立大鼠早期动脉粥样硬化模型，造成血管内皮细胞损伤，探讨淡豆豉对血管内皮损伤的保护作用及其作用机制。
       1.1  药物与试剂 淡豆豉，均购自石家庄市乐仁堂药店，实验前淡豆豉提取物80%乙醇提取两次，2 h/次，减压浓缩至4 g生药/ml备用。吉非罗齐，保定市古城药厂，批号040625，实验前用CMC溶解，配制浓度为0.016 g/ml溶液备用；TC，TG，LDL，HDL试剂盒，日本协和株式会社提供。
       1.2  动物SD大鼠（二级），体重180～200 g，雄性，由河北省实验动物中心提供，许可证号为SCXK（冀）2003－1－003，动物饲料亦由该中心提供。
       1.3  仪器全自动生化分析仪（瑞士）；透射式电子显微镜（日立H-7500型）；Epics-XLⅡ型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司。
       1.4  方法
       1.4.1  动物模型 采用高脂饲料喂养10周造成大鼠高脂血症模型（高脂饲料配方：2%胆固醇，0.5%胆酸钠，10%猪油，0.02%他巴唑，普通饲料87.48%）。
       1.4.2  分组与给药  将大鼠随机分为5组。分别为正常对照组、模型对照组、淡豆豉提取物低剂量组（20 g生药/kg）、淡豆豉提取物高剂量组（40 g生药/kg）及阳性药吉非罗齐对照组(0.16 g/kg)。自造模开始，淡豆豉高剂组每日灌胃给予4 g生药/ml的淡豆豉提取物，淡豆豉低剂组每日灌胃给予2 g生药/ml的淡豆豉提取物，阳性对照组每日灌胃给予0.016 g/ml吉非罗齐混悬液，模型对照组和正常对照组给予等容量的自来水。
       1.5  检测方法
       1.5.1  血清脂质及脂蛋白测定给药10周后，各组大鼠禁食12 h，分别用乙醚麻醉，眶后静脉取血，分离血清，全自动生化分析仪测定TC，TG，LDL，HDL水平。
       1.5.2  流式样品制备与检测各组随机取6只大鼠，剖取胸主动脉约2 cm长，剥取内膜，70%乙醇固定，制备单细胞悬液，碘化丙啶染色，同时设阴性对照，以替代一抗，阳性对照只加一抗或只加二抗，流式细胞仪检测血管内皮细胞的凋亡及Caspase-3的蛋白表达，数据采集为对数(log)方式，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析。计数10000个细胞，计算凋亡率（AP）。
       
       AP（%）=凋亡细胞数细胞总数×100%
       
       用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析，计算出DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数(PI)表示细胞的增殖活性。公式：
       
       PI（%）=S+G2/MG0/G1+S+G2M×100%
       1.5.3  主动脉形态学检查方法各组剩余4只大鼠用4%多聚甲醛灌注固定后，自主动脉弓处剪取等长的动脉条，沿腹侧剖开，内膜面向上，平铺冰盘上取材，置10%甲醛固定，石蜡切片，HE染色，光镜显微镜下观察动脉病理组织学改变；另取2 mm×3 mm主动脉标本，用2.5%戊二醛2 ml固定，透射电镜观察内膜面形态特点。
       1.6  统计学处理所得数据用SPSS软件包（Version 11.5）采用方差齐性检验及t检验。
       2  结果
       2.1  对早期动脉粥样硬化大鼠血脂水平的影响  结果见表1。从结果可见，模型对照组大鼠血清TC，TG，LDL，HDL均较正常对照组大鼠升高（P<0.05或P<0.01），表明大鼠连续10周喂养高脂饲料，已造成大鼠脂代谢紊乱。淡豆豉提取物组（20，40 g生药/kg）及阳性对照药组大鼠血清TC，TG，LDL均较模型组显著降低（P<0.01）。
       表1  淡豆豉提取物对早期动脉粥样硬化大鼠血脂及脂蛋白的影响（略）
       与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；n=10
        
       2.2  对早期动脉粥样硬化大鼠主动脉病理形态学的影响
       2.2.1  光镜观察结果正常对照组内膜完整而光滑,中膜平滑肌走行清晰,无增生；病理模型组内皮细胞大部缺失，中膜平滑肌细胞增生明显，排列紊乱，血管壁增厚；淡豆豉高、低剂量组内膜光滑连续，中膜平滑肌厚度均匀，走行无明显异常，均好于模型对照组。
       2.2.2  透射电镜结果正常组内皮完整，细胞间连接紧密，平滑肌细胞呈长梭形，胞浆内含大量肌丝，细胞器较少，细胞核完整。模型组内皮细胞破损，部分脱落残缺，内皮间连接处胞质分离，变直、变宽，出现较大间隙，其胞浆内可见脂质空泡形成。内膜下间隙明显变窄或消失，可见平滑肌走行紊乱，形状不规则，多个胞突形成，有的呈典型的内膜下迁移，伸出伪足将破损的内皮细胞拱起，部分细胞体积肥大，核不规则，胞浆内肌丝减少，细胞器增多，多量脂质空泡及髓磷脂小体形成，细胞间质增宽，基质增多。阳性组、淡豆豉各组可见内皮细胞较完整；覆盖于内膜表面，细胞连接好。内膜下间隙明显变的规则、清晰，较模型组增宽。平滑肌细胞突起明显减少；胞浆内空泡少见或无，核形状较规则。淡豆豉高剂组微绒毛减少，细胞器较完整，中剂组内皮细胞、微绒毛数量减少，低剂组微绒毛数量减少，部分细胞质高度水肿，吞饮小泡相对较多（见图1～5）。
       图1  正常对照组（10 000×）（略）               
       图2  模型对照组（10 000×）（略）   
       图3  淡豆豉高剂量组（8 000×）（略）
       
       图4  淡豆豉低剂量组（8 000×）（略）  
       图5  阳性对照组（20 000×）（略）   
       2.3  内皮细胞凋亡率及Caspase-3蛋白表达变化 结果见表2。从结果可见，模型对照组内皮细胞的凋亡率、Caspase-3的蛋白表达量显著高于正常对照组（P<0.01），而增殖指数明显低于正常对照组；淡豆豉提取物组（20，40 g生药/kg）内皮细胞的凋亡率显著降低（P<0.01），而增殖指数显著增高(P<0.05)，Caspase-3蛋白表达量比模型组减少（P<0.05或P<0.01）。
       3  讨论
          
       本实验采用高脂食饲法造成大鼠早期动脉粥样硬化模型。实验中发现模型对照组大鼠主动脉内皮细胞凋亡率明显较正常对照组大鼠升高，增殖指数明显降低，Caspase-3的蛋白表达也明显高于对照组；光镜及电镜观察也都发现其血管内皮细胞有明显的受损。
       
       血管内皮细胞(VEC)是介于血液与血管壁之间的屏障，其形态结构受损和功能改变，会导致血管屏障功能的损害，使血液中的脂质和单核细胞等更易沉积在内皮下间隙，进一步形成泡沫细胞，而导致高脂血症(AS)。目前被普遍接受的Ross“损伤反应”学说认为，内皮细胞功能性的损伤是AS形成早期的始动环节，也说明了AS与血管内皮细胞之间关系密切。
       表2  淡豆豉提取物对高脂血症大鼠血管内皮细胞AP 、PI、Caspase-3的影响（略）
       与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01
       
       细胞凋亡是机体生长发育，细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡的过程。近几年发现细胞异常凋亡在多种心血管疾病的发生与发展中起重要的作用，特别是在高脂血症斑块中发现内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞都经历着凋亡与坏死，而凋亡占主导地位，参与AS的形成过程［4，5］。细胞凋亡是正常血管壁基本细胞学事件，通常情况下即有发生，在AS斑块中明显加剧，出现大量细胞凋亡与细胞增殖，组成AS斑块的病理基础。大量研究也证实了人类AS斑块中存在细胞凋亡。由于凋亡细胞在体内存在时间极短，低比例的凋亡发生即意味着大量的细胞凋亡已经发生［6］。Caspase-3属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，在破坏细胞骨架结果方面有重要作用，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆地走向死亡。因此，若能控制该酶的活性对凋亡的结局可产生重要影响。本实验发现对早期动脉粥样硬化大鼠应用淡豆豉提取物后，内皮细胞Caspase-3的蛋白表达下调，凋亡率较模型对照组降低，增殖指数增加。实验结果提示，淡豆豉提取物对早期动脉粥样硬化大鼠血管内皮损伤有明显的防治作用，其机制可能通过下调Caspase-3的蛋白表达，调节血管内皮细胞凋亡与增殖的平衡有关，其他机制途径将另文发表。
       【参考文献】
         　　［1］ 王鑫国，葛喜珍，白 霞，等.淡豆豉对去卵巢大鼠脂代谢的影响［J］.中药材，2003，26（9）：652.
       
       ［2］ 高淑丽，牛丽颖，曹秀莲，等.淡豆豉提取物抗心肌缺血作用的研究［J］.河北医药，2007，29（9）：923.
       
       ［3］ 牛丽颖，刘 娇，崔力剑，等.淡豆豉对早期动脉粥样硬化大鼠血管内皮损伤的保护作用［J］.中药药理与临床，2007，23（5）：923.
       
       ［4］ Kockx MM, Knaapen MW.The role of apoptos is in vascular disease［J］.J Pathol,2000,190(3):267.
       
       ［5］ Han DK, Haudensch ild CC,Hong MK, et al.Evidence for apoptosis in human atherogenes is and in a rat vascular injury mode［J］.Am J Pathol,1995,147(2):267.
       
       ［6］ Alvarez RJ, Gips SJ. Moldovan Vetal［J］.Biochen Biophy Res Commun,1997,237:372.