文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨粉防己碱（Tet）对肝星状细胞（HSC）增殖的调控机制。方法培养大鼠HSC，MTT法测Tet对HSC增殖的影响，免疫细胞化学法测Tet对HSC增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期素D1（CyclinD1）表达的影响。结果 Tet在0.5～1 mg/L的范围内显著抑制大鼠肝星状细胞的增殖(P<0.05)。 0.5，1 mg/L Tet浓度组PCNA阳性表达细胞数与对照组有显著性差异(P<0.01)，两浓度组之间也存在显著性差异(P<0.01)。 Tet 0.5，1 mg／L浓度组CyclinD1阳性表达细胞数与对照组有显著性差异(P<0.01)， 两浓度组之间差异有显著性 (P<0.01)。结论Tet通过抑制细胞周期素CyclinD1，PCNA表达，使细胞周期停滞于 G0/G1期，从而发挥抑制大鼠肝星状细胞增殖的作用。
       【关键词】  粉防己碱 肝星状细胞 增殖细胞核抗原 细胞周期素D1 免疫细胞化学
       Regulative Effect of Tetrandrine on the Proliferation and Expression of PCNA, CyclinD1 of Hepatic Stellate Cells
       ZHAO Hongxian，CHEN Xia*, GUO Yong，LI Changping , CHEN Zhuang, YU Hong
       （Department of Histology and Embryology, 2.Affiliated Hospital, Luzhou Medical College, Luzhou,Sichuan  646000, China）
       Abstract：ObjectiveTo observe the effect of tetrandrine on the proliferation and expression of PCNA, CyclinD1 of hepatic stellate cell.MethodsHepatic stellate cells were cultured in RPM1640 medium . The effect of tetrandrine with various concentrations on the proliferation of hepatic stellate cell was observed with the MTT method. The effects of tetrandrine with various concentrations on the expression of PNCA, cyclinD1 of hepatic stellate cells were observed with immunocytochemistry. Results①From 0.5 mg/L to 1mg/L, tetrandrine inhibited the proliferation of hepatic stellate cell in a concentration dependence manner (P<0.05). There was no significant difference between inhibition of 1mg/L tetrandrine and 2mg/L tetrandrine. ② The number of the PCNA positive cells in 0.5mg/L,1mg/L tetrandrine groups were less than that of normal control group(P<0.01), and the number of the PCNA positive cells had significant difference between 0.5mg/L and 1mg/L tetrandrine groups(P<0.01). ③The number of the CyclinD1 positive cells in 0.5mg/L,1mg/L tetrandrine groups were less than that of normal control group(P<0.01), and the number of the CyclinD1 positive cells had significant difference between 0.5mg/L and1mg/L tetrandrine groups(P<0.01).ConclusionTetrandrine can decrease the expression of PCNA and CyclinD1 of hepatic stellate cells, and make cell cycle arrest in G0/G1 stage, which may be the mechanism that  tetrandrine inhibits the proliferation of hepatic stellate cell.
       Key words：Tetrandrine；  Hepatic stellate cell；  PCNA；  CyclinD1；  Immunocytochemistry
       
       粉防己碱（Tetrandrine，Tet）是粉防己的主要活性成分，有着广泛的药理作用，应用前景广阔，抗纤维化是其重要的药理作用，Tet是抗肝纤维化的有效药物［1］。各种致病因素引起肝脏损伤，细胞因子刺激肝星状细胞激活增殖及转化,细胞外基质(ＥＣＭ)合成增多及降解减少，继而沉积在细胞间隙,从而发生纤维化。Tet不仅能直接抑制肝贮脂细胞的增殖及转化,而且可阻断血小板衍生因子的促肝贮脂细胞增殖及胶原合成作用。Tet可通过转化生长因子-β信号抑制体外培养大鼠肝星状细胞活性［2］。但是Tet抑制肝星状细胞增殖的具体机制不是很清楚，本研究观察Tet对肝星状细胞增殖过程中增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期素D1(CyclinD1)的表达的影响，从细胞周期调控角度探讨Tet影响肝星状细胞增殖的机制。
       1  器材与方法
       1.1  材料大鼠肝星状细胞株，泸州医学院附属医院传染免疫实验中心保存。
       1.2  仪器与试剂CO2恒温培养箱（美国Shel-Lab公司）；YJ-1450型医用净化工作台（苏州长春电子仪器厂）；1X71型倒置相差显微镜（日本Olympus光学仪器有限公司）。
       
       粉防己碱（成都四川省药检所）；RPMI1640培养基（美国Gibco公司）；小牛血清（成都哈里生物公司）； PCNA单克隆抗体（NeoMarkers公司）； CyclinD1单克隆抗体（NeoMarkers公司）；ABC免疫组化试剂盒（深圳晶美生物有限公司）。其余试剂均为市售分析纯产品。
       1.3  大鼠肝星状细胞培养 用含10%小牛血清的RPMI1640培养基将肝星状细胞培养于37℃,5%CO2孵箱中,换液1次/d，当细胞贴满培养瓶瓶底约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞，进行传代培养，并细胞及时冻存备用。
       1.4  MTT法测Tet对细胞增殖的影响 取对数生长期细胞，于加药前24 h消化后以1×104/ml接种于96孔板中,置于37℃,5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将细胞分为 5 组:空白对照组（正常培养基）、0.25 mg/L组（培养基含0.25 mg/L Tet）、0.5 mg/L组（培养基含0.5 mg/L Tet）、1 mg/L组（培养基含1 mg/L Tet）、2 mg/L组(培养基含2 mg/L Tet)，每组设12个复孔。 加药前以无血清培养基洗细胞3次。Tet处理24 h后 ，每孔加入 MTT溶液(5 μg/m1)20 μl，37℃继续培养 4 h后终止反应，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，用酶标仪测各孔波长在490 nm的OD值，并以下列公式计算细胞抑制率 ：细胞抑制率=(空白对照组平均OD值-处理组平均OD值)／空白对照组平均OD值×l00%。
       1.5  免疫细胞化学实验取对数生长期细胞，于加药前24 h消化后以4×104/ml接种于置有经多聚赖氨酸处理的盖玻片的24孔板中，置于37℃,5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将细胞分为3组：空白对照组（正常培养基）、0.5 mg/L组（培养基含0.5 mg/L Tet）、1 mg/L组（培养基含1 mg/L Tet）。加药前以无血清培养基洗细胞3次。Tet处理24 h后上，PBS洗细胞3次，4%多聚甲醛固定细胞15 min，4%Tri-tonX-100通透细胞 30 min，过氧化物酶阻断剂孵育10 min，非免疫性动物血清中孵育10 min，加一抗4℃冰箱过夜后，生物素标记的二抗中孵育10 min，加SABC复合物孵育10 min，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，照相。以 PBS代替一抗作阴性对照。每组细胞各进行6次独立性实验。 PCNA、cyclinD1阳性结果判断：PCNA染色：细胞核着色，染成棕黄（褐）色为阳性，浅（灰）蓝色视为阴性；cyclinD1染色：细胞核着色，染成棕黄（褐）色为阳性，浅（灰）蓝色视为阴性。400倍镜下，PCNA、cyclinD1指数通过随机选择5个高倍视野，每视野计数100个细胞中的阳性细胞数。取平均数作为计数指标。
       1.6  统计学分析结果用 ±s表示，数据统计分析利用SPSS 14.0软件完成，比较采用单因素方差分析，以 P<0.05为差异有显著性。
       2  结果
       2.1  Tet对肝星状细胞增殖的影响用MTT法检测了不同浓度药物对细胞增殖的影响， Tet在0.5～1 mg/L的范围内显著(P<0.05)抑制大鼠肝星状细胞的增殖，呈现剂量依赖性，1 mg/L 与2 mg/L Tet对大鼠肝星状细胞的增殖抑制作用无显著差异(结果见表1)。
       表1  不同浓度Tet对肝星状细胞增殖的影响（略）
       与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01;△示培养24 h时所测OD值
       2.2  Tet对肝星状细胞PCNA表达的影响PCNA以细胞核表达为主，细胞质也有表达。Tet 0.5,1 mg/L浓度组PCNA阳性表达细胞数与对照组有显著性差异(P<0.01)，两浓度组之间也存在显著性差异(P<0.01)。 见表2， 图1。
       2.3  Tet对肝星状细胞CyclinD1表达的影响CyclinD1以细胞核表达为主，细胞质也有表达。Tet 0.5，1 mg／L浓度组CyclinD1阳性表达细胞数与对照组有显著性差异(P<0.01)，两浓度组之间也存在显著性差异(P<0.01)。见表2， 图2。
       表2  Tet对肝星状细胞PCNA及CyclinD1表达的影响（略）
       表身中数据为每视野中个数；与对照组比较，﹡P<0.01；1 mg/L组与0.5 mg/L组比较，▲P<0.01
       图1  各组PCNA阳性表达情况，SABC法染色，×400（略）
       图2  各组CyclinD1阳性表达情况，SABC法染色，×400（略）
       3  讨论
          
       粉防己碱（Tetrandrine，Tet）是从中草药粉防己的根块中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，是粉防己的主要活性成分。Tet是天然的非选择性的钙通道阻滞剂，又是钙调蛋白的拮抗剂，有着广泛的药理作用，应用前景广阔，抗纤维化是其重要的药理作用， Tet是抗肝纤维化的有效药物［1］。本研究通过MTT法发现在一定浓度范围内，Tet能够浓度依赖性的抑制大鼠肝星状细胞增殖。在真核细胞的细胞周期调控中，G0/G1-S期之间的调控点(restriction point，又称R点)是细胞内外信号经传递、整合，汇集到细胞核对细胞增殖进行调控的关键点，由G1期周期蛋白cyclinD1等调控［3，4］。细胞能否通过限制点从G1期进入S期很大程度上取决于G1期内CyclinD1的积累［5］。CyclinD1可与细胞周期蛋白依赖激酶 (cyclin dependent kinase，CDK)结合形成复合物，在 CDK激酶的介导下发生磷酸化，从而促进某些基因的表达 ，这些基因的表达产物可促使细胞通过G1-S调控点 ，使细胞进入自主分裂程序［6，7］。本实验通过免疫细胞化学进一步研究发现大鼠肝星状细胞中存在CyclinD1的表达，在一定范围内，随着Tet浓度的增加，大鼠肝星状细胞CyclinD1蛋白的表达逐渐减少。说明Tet可通过降低细胞周期素CyclinD1的表达而抑制大鼠肝星状细胞增殖。PCNA又称作细胞周期蛋白、DNA聚合酶6辅助因子等，在细胞DNA复制、细胞周期运行中发挥重要作用，PCNA合成与细胞增殖状态关系密切。PCNA从细胞G1后期开始出现表达，S期达高峰，M期表达出现下降，G0期则不表达。各种刺激因子可通过不同的途径诱导肝星状细胞增殖，但都必须通过PCNA的表达这一中间环节，因而它是细胞增殖的必经之路。本研究发现在一定范围内，随着Tet浓度的增加，大鼠肝星状细胞PCNA表达也逐渐减少。说明PCNA表达减少也参与了Tet抑制大鼠肝星状细胞增殖的机制。
       
       可见Tet可以通过降低大鼠肝星状细胞CyclinD1、PCNA表达，进而发挥抑制大鼠肝星状细胞增殖的作用，具体途经可能是Tet通过阻滞钙离子通道，降低细胞内钙离子浓度，抑制钙离子信号途径，降低Cyclin D1蛋白表达进而减少PCNA蛋白表达，后者则阻止细胞通过G1-S调控点进入S期，使其停滞于 G0/G1期，如此细胞无法进入自主分裂程序，细胞增殖便受到抑制。
       【参考文献】
         　　［1］ Chen YW, Li DG．Progress in study of tetrandrine on antihepatofibrosis［J］.Zhonghua Xiaohua Zazhi, 2000,20:47.
       
       ［2］ Chen YW, WU JX, et al. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factor-beta signaling［J］.World J Gastroenterol. 2005 ，11(19):2922.
       
       ［3］ Bellacosa A, Almadori G, Cavallo S, et al. CyclinD1 gene amplification in human laryngeal squamous cell carcinomas: prognostic significance and clinical implications［J］.Chin-cancer-Res.1996, 2:175.
       
       ［4］ Cattam P, Hohaus S, Bellacosa A, et al. Association between cyclinD1（CCND）gene anplification and human papillomavirus Infection in human laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Chin-cancer-Res.1998，4:2595.
       
       ［5］ 曹跃琼， 乔守怡，赵寿元. 细胞周期抑制蛋白cyclinD1及INK4研究进展［J］.国外医学分子生物学分册，1998, 20:1.
       
       ［6］ Calbo J, Parreno M, Sotillo E, et a1. Gl cyclin/cyclin-dependent kinase-coordinated phosphorylation of endogenous pocket proteins differentially regulates their interactions with E2F4 and E2FI and gene expression［J］.J Biol Chem, 2002, 277:50263.
       
       ［7］ Lents N H, Keenan SM, Bellone C, et a1. Stimulation of the Raf/MEK/ERK cascade is necessary and sufficient for activation and Thr-l60 phosphorylation of a nuclear-targeted CDK2［J］. J Biol Chem. 2002, 277：47469.