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       【摘要】 
       目的研究葛根素在乙醇／硫酸铵两水相体系中的分配特性及其影响因素。方法变化体系中乙醇的浓度、添加不同分子量及浓度的ＰＥＧ、改变体系ｐＨ 值。结果葛根素的分配系数与回收率和体系中乙醇的浓度成正比，小分子量的ＰＥＧ 更有利于葛根素在上相的分配，增加ｐＨ 值，对提高葛根素的分配系数有正面影响。结论最佳分配体系是向组成为乙醇（２１％）／硫酸铵（２０％）的体系中添加５％（W／W）的ＰＥＧ４００，最佳萃取环境为ｐＨ ＝７．８。
       【关键词】  葛根素 两水相体系 分配系数
       The Partition Properties of Puerarin in Aqueous Two －Phase System of Ethanol ／Ammonium Sulfate
       ＷＡＮＧ Ｚｈｉｈｕｉ， ＺＨＵ Ｊｉａｎｈａｎｇ*， ＺＨＥＮＧ Ｎａｎ， ＬＩＵ Ｇｕｏｊｉｎ， ＺＨＥＮ Ｃｈｅｎ， ＤＡＩ Ｌｉｎｇ
       （School of Environmental Science and Engineering， Nanchang University， Nanchang， Jiangxi ３３００３１， China）
       Abstract:ObjectiveＴｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｔｉａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｐｕｅｒａｒｉｎ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ －ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ／ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ．MethodsＣｈａｎｇｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ ， ａｄｄ ＰＥＧ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｌａｒ ｍａｓｓ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｖａｌｕａｔｅ ｐＨ．ResultsＰａｒｔｉｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｐｕｅｒａｒｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ， ＰＥＧ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｍｏｌａｒ ｍａｓｓ ｃｏｕｌｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｐｕｅｒａｒｉｎ ｔｏ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｏｐ ｐｈａｓｅ ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐＨ ｗａｓ ｍｏｒｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｐｕｅｒａｒｉｎ ．ConclusionＥｔｈａｎｏｌ（２１％）／Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ（２０％） ｗｉｔｈ ５％（W／W） ＰＥＧ４００ ｉｓ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐＨ ｉｓ ７．８％．
       Key words:Ｐｕｅｒａｒｉｎ；  Ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ －ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ；  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
       
       葛根是常用中草药，为豆科植物野葛的块根，其有效成分主要为葛根素。葛根素具有扩张冠状动脉、降低血压、抗心率失常、改善微循环、降血糖等功效［１］ 。１９９３ 年，卫生部批准葛根素注射液作为改善心脑血管循环的新药用于临床，目前已成为各大医院心脑血管治疗用药的前三位首选药物之一。近年来，伴随着心脑血管疾病患者的不断增多，天然来源的葛根素产品受到了广泛的关注。
       
       目前，葛根素的分离纯化工艺主要包括铅盐沉淀法、大孔树脂吸附法、微波辅助萃取法、高速逆流色谱法等。但铅盐沉淀法得率较低，且铅对环境存在污染；大孔树脂吸附操作后产品的纯度有限，需要后续工艺继续纯化；而微波辅助萃取过程萃取机理尚不明确，其效率依赖于细胞壁破碎率；高速逆流色谱法还只能用于小批量的纯化分析。因此，葛根素产品的新型高效分离纯化技术仍是工艺开发的一个方向。
       
       两水相体系（ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ －ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ，简称ＡＴＰＳ）作为一种新型萃取体系，始于２０ 世纪５０ 年代，是由两种亲水性物质的水溶液在一定浓度下混合自发形成的两相体系，具有萃取条件温和、处理量大、易工程放大、操作简单和可连续操作等优点［２］。
       
       目前，两水相体系已被广泛应用于甘草酸［３］、芦丁［４］、黄芩黄酮［５］等天然化合物的分离纯化，成为中草药有效成分提取工艺的一个重要组成部分。
       
       乙醇／（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 两水相体系作为研究最为广泛的体系之一，成相物质（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 理化性质稳定，被广泛用于酶和蛋白质等生物大分子分离的盐析过程［６］，同时乙醇作为葛根素的良好溶剂具有易回收、价格低廉等优点。与其它无机盐、有机溶剂形成的两水相体系相比，乙醇／（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 两水相体系可为葛根素的分离纯化提供一个更为温和的环境，已经有将该体系应用于萃取甘草酸钾［７］的报道，但未见应用于其它天然药物成分及化合物的分离报道。
       1  器材
       １．１  药品葛根素标准品由西安中鑫生物技术有限公司提供（纯度≥９９％）；（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ （分析纯）购自湖南长沙精细化工实业有限公司；无水乙醇（分析纯） 由江西洪都试剂厂生产；ＰＥＧ４００，１０００，４０００ 均为市售分析纯。
       １．２  仪器ＫＤＣ －１６０ＨＲ 高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；ＵＶ７６２ 紫外／可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
       2  方法
       ２．１  分析方法采用紫外分光光度法检测［８］，线性回归方程为C＝１３．５８４ ×A－０．１４２ ３，r＝０．９９９ ７。
       ２．2  两水相体系的制备两水相体系在２５℃下配制，系统总质量设计为１０ ｇ，各组分均以质量浓度表示。在１５ ｍｌ 刻度离心试管中加入０．３９ ｍｇ／ｍｌ 的葛根素水溶液１ ｍｌ 和一定量的硫酸铵、乙醇，不足部分以水补充，同时配制相同组成但不含葛根素的空白溶液作为参比；充分混匀，于５ ０００ ｒ／ｍｉｎ 下离心２０ ｍｉｎ 后，置于２５℃恒温水浴锅中使其平衡过夜；待其界面稳定后读出上下相的体积并计算相比R；分别对上、下相溶液取样分析，并计算葛根素的分配系数K和回收率Y。计算公式如下：
       
       R ＝Vｔ ／Vｂ；
       
       C ＝１３．５８４ ×（A －Aｂ） －０．１４２ ３；
       
       K ＝Cｔ ／Cｂ；
        
       Y ＝R ×K／（１ ＋R ×K）
       3  结果
       ３．1  乙醇质量浓度对葛根素分配的影响固定体系中（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 浓度为２０％，改变乙醇的质量浓度，考察乙醇含量对体系相比和葛根素分配的影响（见表１）。由表１ 可知，体系相比与乙醇的质量浓度成正比。当两相体系中乙醇浓度较低时，无机盐与水分子缔合而富集于下相，少量乙醇分子滞留其中［９］。随着乙醇浓度的增加，无机盐的盐析作用也相应增强［１０］，下相中的乙醇分子被逐渐释放出来，并夺取下相中的水分子与之缔合而向上相富集，体系相比随之增大。作为葛根素的良好溶剂，随着乙醇含量的增加，葛根素逐渐向上相富集，当乙醇质量浓度为２６％时分配系数K值达到最大，为１６．３０，此时回收率为９４．３３％。
       表1  乙醇的质量浓度对葛根素分配的影响（略）
       ３．２  ＰＥＧ 对葛根素分配系数的影响ＰＥＧ 是一种常用的两水相成相物质。ＰＥＧ 与无机盐形成两水相的过程已广为研究，但其作为添加剂对水溶性有机溶剂／无机盐两水相体系中物质分配的影响还未见报道。从乙醇／硫酸铵和ＰＥＧ／硫酸铵的相图（图１）对比可知，乙醇在乙醇／硫酸铵两水相体系下相中的浓度比ＰＥＧ／硫酸铵两水相体系下相中ＰＥＧ 的浓度均要高，且下相ＰＥＧ 的浓度随其分子量的增加而递减，依次为乙醇＞ＰＥＧ４００ ＞ＰＥＧ１０００ ＞ＰＥＧ４０００。这主要是因为伴随ＰＥＧ 分子链的延长，其分子的空间位阻效应也增强，且末段羟基数量减少，因而其水溶液的疏水性增强。因此伴随着ＰＥＧ 分子量的提高，它与硫酸铵溶液形成两相体系所需要的浓度也相应降低［１１］。
       图1  两水相相图（略）
       
       从图１ 可知， 乙醇／（ ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 的两相区域较小。当（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 为２０％时，乙醇在２０％ ～２６％范围内能较好地形成两相体系。体系中乙醇浓度高于２６％时，添加少量ＰＥＧ 即有硫酸铵析出，形成三相体系；当乙醇小于２０％时，两相体系接近单相区，不宜作为考察对象。因此， 实验过程中主要以乙醇（２１％）／（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ （２０％）两水相体系为对象，考察ＰＥＧ 对体系相比和葛根素分配的影响。从图２ 可知，ＰＥＧ 的添加增加了无机盐的盐析作用，因此体系相比增加。但由于低分子量的ＰＥＧ 分子较小，分子末端拥有较多的羟基，亲水性较强，极性强于高分子量的ＰＥＧ，根据相似相容的原理，低分子量的ＰＥＧ 更容易与乙醇混溶，这对于乙醇向上相的富集更为有利，因此ＰＥＧ４００ 对体系相比和葛根素分配系数的影响最大。而高分子量的ＰＥＧ 由于疏水性增加，极性减弱，且在下相中的浓度较低，因此对于增加乙醇向上相富集的作用较小，故对体系相比和葛根素分配系数的提高作用不如低分子量的ＰＥＧ 明显。
       
       表２ 表明分配系数和相比随体系中ＰＥＧ４００ 质量浓度的增加而增加。这是由于ＰＥＧ 作为成相物质之一，它的存在增加了硫酸铵的盐析作用，使更多的乙醇分子向上相富集，从而使体系相比和葛根素的分配系数K值上升。
       图2  PEG对乙醇(21%)/硫酸铵(20%)两相体系相比和葛根素分配的影响（略）
       表2  PEG400对乙醇(21%)/(NH4)2SO4(20%)相比和葛根素分配的影响（略）
       ３．3  ｐＨ 值对葛根素分配系数的影响由于葛根素是一种多酚类物质，易离解成苯氧负离子和氢离子［１２］，因此调节体系的ｐＨ 值将会对葛根素自身的净电荷产生影响，同时将改变两相之间的电位差［１３］，最终影响K值。根据相平衡热力学理论推导的物质分配系数表达式［１３］如下：
       
       1nK=1nK0+FSRT△φ
       
       由上式可知荷电物质的分配系数的对数与它的净电荷数和相间电位差成正比［１３］。
       
       本实验在乙醇（２１％） ／（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ （２０％） ／ＰＥＧ（５％）两水相体系中，采用ＫＨ２ ＰＯ４ －ＮａＯＨ 缓冲液调节体系的ｐＨ 值，考察不同ｐＨ 值对分配系数K 值的影响。图３ 显示，ｐＨ 值在５．８ ～７．８范围内变化时，分配系数呈逐渐上升的变化趋势。这说明ｐＨ的变化改变了葛根素的电性，同时也改变了盐的分配情况及两相之间的电位差，故K 值发生变化。当ｐＨ ＞７ 时，葛根素带负电，随着体系ｐＨ 值的升高，缓冲盐在两相间的不均衡分配增加了体系的相间电位差，葛根素逐渐向电位为正的上相富集，分配系数随之增加；当ｐＨ ＜７ 时，葛根素带正电，随着体系ｐＨ 值的降低，葛根素向下相富集的趋势与缓冲盐造成的相间电位差的增加相比占主导地位，所以分配系数降低。从图３ 中可知，当ｐＨ ＝７．８时，分配系数达到最大。
       图3  pH值对葛根素在乙醇(21%)/硫酸铵（略）
       4  结论
          
       乙醇／硫酸铵两水相体系价格低廉、低毒、较易挥发且无需反萃取，具有很大的应用前景。实验表明葛根素的分配系数和回收率随体系中乙醇的质量分数的增加而增加，添加少量的ＰＥＧ 即可显著提高葛根素的分配系数和回收率，并与体系中ＰＥＧ 的质量浓度成正比，且低分子量的ＰＥＧ 更利于葛根素在上相的分配。结果显示， 葛根素的最佳萃取体系组成是乙醇（２１％） ／（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ （２０％） ／ＰＥＧ４００ （５％），最佳萃取条件为ｐＨ ＝７．８。
       
       公式中字母符号含义：
       
       A—含有葛根素的体系的吸光度；
       
       Aｂ—不含葛根素的空白体系的吸光度；
       
       C—葛根素的浓度（μｇ／ｍｌ）；
       
       Cｔ、Cｂ—葛根素上下相的浓度（μｇ／ｍｌ）；
       
       F—法拉第常数；
       
       K０—分配物质净电荷为零（ｐＨ ＝等电点）时的分配系数；
       
       K—分配系数；
        　
       R—相比；
       
       Vｔ、Vｂ—上下相的体积（ｍｌ）；
       
       Y—回收率；
        
       Z—溶质的净电荷数；
       
       △φ—相间电位；
       【参考文献】
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