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       【摘要】 
       目的研究虎杖疏松愈伤组织诱导的最佳激素条件。方法通过单因素和正交实验研究不同外植体、不同浓度的激素组合对虎杖愈伤组织诱导率、疏松程度以及增殖率的影响。结果以诱导率为指标，ＮＡＡ 对虎杖细胞脱分化影响最显著。以增殖率为指标，２，４ －Ｄ 对虎杖的细胞生长分裂影响最显著。结论以叶柄为外植体更容易诱导出疏松的愈伤组织，虎杖愈伤组织诱导和继代增殖最佳的激素组合分别为６ －ＢＡ １．５ ｍｇ／Ｌ ＋２，４ －Ｄ １．０ ｍｇ／Ｌ ＋ＫＴ ０．２ ｍｇ／Ｌ ＋ＮＡＡ０．５ ｍｇ／Ｌ 和６ －ＢＡ ２．０ ｍｇ／Ｌ ＋２，４ －Ｄ ２．０ ｍｇ／Ｌ ＋ＫＴ ０．４ ｍｇ／Ｌ ＋ＮＡＡ ０．４ ｍｇ／Ｌ。
       【关键词】  虎杖 疏松愈伤组织 诱导 增殖
       Study on the Loose Callus Induction of Polygonum cuspidatum
       ＺＥＮＧ Ｃｈａｏｚｈｅｎ， ＬＩＵ Ｚｈｉｘｉａｎｇ，ＬＩ Ｊｉｌｉｅ，ＷＵ Ｙａｏｈｕｉ
       （College of Life Science and Technology， Central South University of Forestry and Technology， Changsha ４１０００４， China）
       Abstract：ObjectiveTo sｔｕｄｙ the ｏｐｔｉｍｕｍ ｈｏｒｍｏｎｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｌｏｏｓｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Polygonum cuspidatum．MethodsＢｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ， ｌｏｏｓｅｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Polygonum cuspidatum were ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ResultsＮＡＡ had ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ２，４ －Ｄ ｈａd ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Polygonum cuspidatum．ConclusionLeafstalk is ｍｕｃｈ ｅａｓｉｅｒ ｔｏ ｌｏｏｓｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎ ｄｕｃｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ａｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ６ －ＢＡ １．５ ｍｇ／Ｌ ＋２，４ －Ｄ １．０ｍｇ／Ｌ ＋ＫＴ０．２ｍｇ／Ｌ ＋ＮＡＡ０．５ ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ６ －ＢＡ２．０ ｍｇ／Ｌ ＋２，４ －Ｄ２．０ｍｇ／Ｌ ＋ＫＴ０．４ｍｇ／Ｌ ＋ＮＡＡ０．４ ｍｇ／Ｌ．
       Key words：Polygonum cuspidatum；  Ｌｏｏｓｅ ｃａｌｌｕｓ；  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；   Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
       
       虎杖Polygonum cuspidatum 是蓼科蓼属多年生灌木状的草本植物［１］ ，具有散风利湿、止咳去痰、清热解毒、活血化淤的功效，其成分主要为蒽醌类、黄酮类、芪类化合物和酚性成分等，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、抗菌和治疗心血管疾病的作用［２ ～５］ 。
       
       近年来，虎杖中的芪类化合物——白藜芦醇是研究热点，随着白藜芦醇的需求量越来越大，由于过度的开发，使得虎杖野生资源面临枯竭。因此利用虎杖组织和细胞培养大规模生产白藜芦醇，是一个重要的解决途径。目前，对虎杖的组织培养已有一些研究［６，７］，但对虎杖的疏松愈伤组织的诱导和增殖还未见报道。本研究优化虎杖愈伤组织的诱导条件，以诱导出生长旺盛、质地疏松的愈伤组织，为虎杖细胞悬浮培养提供试验基础。
       １  材料与方法
       １．１  材料虎杖幼嫩植株采于湖南中医药大学种植基地。
       １．２  方法
       １．２．１   外植体消毒选取幼嫩虎杖的叶柄作为外植体，用流水冲洗干净６ ～１０ ｍｉｎ，７５％酒精浸泡３０ ｓ，无菌水洗涤３ 次，再用０．１％升汞溶液消毒１０ ｍｉｎ，无菌水冲洗３ 次，把叶柄切成０．５ ｃｍ大小，接种于含不同植物生长调节物质的ＭＳ 固体培养基上进行培养。培养条件：温度（２５ ±２）℃，光照强度１ ２００ ｌｘ，光照１２ ｈ／ｄ，每２５ 天继代１ 次。
       １．２．２   不同外植体诱导实验分别选用虎杖叶柄、叶片和茎作为外植体，接入ＭＳ ＋ＮＡＡ １．０ ｍｇ／Ｌ ＋ＫＴ ０．１ ｍｇ／Ｌ 的培养基中培养２５ ｄ 后，计算其诱导率。
       １．２．３  愈伤组织的诱导本实验以ＭＳ 为基本培养基，分别添加不同浓度配比的６ －ＢＡ及２，４ －Ｄ，ＫＴ，ＮＡＡ，采用正交实验考察植物激素对虎杖愈伤组织诱导的影响，得到最佳的激素配比。Ｌ９ （３４ ）实验见表１。
       表1  因素水平表（略）
       １．２．４   愈伤组织的继代培养选用颜色、质地均一、疏松而无定形的愈伤组织进行继代增殖，正交实验方案设计见表１，每个处理接种１０ 瓶，接种量为０．３ ｇ／瓶，培养２５ ｄ 后，计算其增殖率。
       １．２．５   结果统计愈伤组织诱导率＝诱导出愈伤组织的外植体块数／接种外植体块数×１００％
       
       愈伤组织增殖率＝Ｗ２ －Ｗ１ ／Ｗ１ ×１００％
         
       Ｗ１ 接种时愈伤组织鲜重，Ｗ２ 收获时愈伤组织鲜重
       ２  结果与分析
       ２．１  不同外植体对虎杖愈伤组织诱导的影响结果见表2。
       表2   外植体对愈伤组织诱导的影响（略）
       由表２ 可知，外植体对虎杖愈伤组织的诱导和生长情况有较大的影响，叶柄最容易诱导出疏松、有活力的愈伤组织。叶片出愈时间最短，５ ｄ 就有愈伤组织在其切口处出现，生长旺盛，但较为致密，诱导率不如叶柄。茎的愈伤组织质地较疏松，但出愈率较低，污染率高。因此以叶柄为外植体进行愈伤组织的培养适合进一步的细胞悬浮培养。
       ２．２  激素对虎杖愈伤组织诱导和增殖的影响结果见表3，图1。
       表3  正交实验与结果（略）
       从表３ 和图１ 分析，各个激素的种类和浓度对虎杖愈伤组织诱导率和增殖率的影响有比较明显的差别，以诱导率为指标，４种生长调节剂对虎杖叶柄的诱导影响大小的顺序为ＮＡＡ ＞ＫＴ ＞２，４ －Ｄ ＞６ －ＢＡ，最佳的激素组合为Ａ２ Ｂ１ Ｃ１ Ｄ３ ，即６ －ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ ＋２，４ －Ｄ １．０ ｍｇ／Ｌ ＋ＫＴ ０．２ ｍｇ／Ｌ ＋ＮＡＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ。２，４ －Ｄ浓度的增加有助于疏松愈伤组织的形成。在继代培养中，以增殖率为指标，４种生长调节剂对虎杖叶柄的诱导影响大小的顺序为２，４ －Ｄ ＞ＮＡＡ ＞６ －ＢＡ ＞ＫＴ，最佳的激素组合为Ａ３ Ｂ３ Ｃ３ Ｄ２ ，即６－ＢＡ ２．０ ｍｇ／Ｌ ＋２，４ －Ｄ ２．０ ｍｇ／Ｌ ＋ＫＴ ０．４ ｍｇ／Ｌ ＋ＮＡＡ ０．４ ｍｇ／Ｌ，采用这种激素组合对虎杖叶柄的愈伤组织进行多次继代培养，获得质地疏松、淡黄色、生长旺盛的愈伤组织。
       图1  因素和指标直观分析图（略）
       3  讨论
          
       虎杖愈伤组织生长过于致密导致难以实现细胞悬浮培养，因此获得疏松、生长快速愈伤组织是实现虎杖细胞悬浮培养的前提。目前，关于虎杖组织培养研究的报道还很少，曹庸等［6］ 通过比较虎杖不同外植体愈伤组织诱导率发现根茎芽的诱导率最高，为７３％，但本试验研究发现虎杖叶柄的诱导率更高。欧菊泉等［7］ 在诱导虎杖愈伤组织研究中发现，ＮＡＡ 诱导愈伤组织比２，４－Ｄ 效果好，ＫＴ 比ＢＡ 好，这与本试验的正交试验结果相符。对于非激素因子，例如蔗糖、ｐＨ、有机添加物、氮源浓度等对虎杖愈伤组织的影响还需要进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］ 谢 扬，朱秋华，严轶琛．虎杖活性成分及其提取分离方法研究概况［Ｊ］．时珍国医国药，２００４，１５（９）：６１５．
       
       ［2］ 薛 岚．中药虎杖的药理研究进展［Ｊ］．中国中药杂志，２０００，２５（１１）：６５１．
       
       ［3］ 杨建文，杨彬彬，张 艾．中药虎杖的研究与应用开发［Ｊ］．西北农业学报，２００４，１３（４）：１５６．
       
       ［4］ Ｍｅｉｓｈｉａｎｇ Ｊ， Ｌｉｎｉｎｇ Ｃ， Ｕ ｄｅａｎｉ Ｇ Ｏ， ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍ．ｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ， ａ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｇｒａｐｅｓ ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７５（１）：２１８．
       
       ［5］ Ｂｕｒｋｎｈａｒｄ Ｓ， Ｒｅｉｔｅｒ Ｒ Ｊ， Ｔａｎ Ｄ Ｘ， ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ ｏｘｉｄａｔｉｖｅｌｙ ｄａｍａｇｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｍｉｕｍ（Ⅲ） ａｎｄ Ｈ２ Ｏ２ ｉｓ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｍｅｌａｔｏｎｎｉｎ， Ｎ（１） －ａｃｅｔｙ１ －Ｎ（２） －ｆｏｍｙ１ －５ｍｅｔｈｏｘｙｋｙｎｕ ｒａｍ ｉｎｅ， ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ａｎｄ ｕｒｉｃ ａｃｉｄ［Ｊ］．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２００１，３３（８）：７７５．
       
       ［6］ 曹 庸，陈 雪，唐永红，等．虎杖愈伤组织的诱导及高产白藜芦醇材料的筛选［Ｊ］．生命科学研究，２００６，１０（３）：２７０．
       
       ［7］ 欧菊泉，陈 雪，丁利华，等．虎杖愈伤组织的诱导及其白藜芦醇形成初探［Ｊ］．中南林学院学报， ２００６，２６（３）：２４．