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       【摘要】 
       目的观察黄芩茎叶总黄酮（Scutellaria Baiculensis Stem-leaf Total Flavonoid，SSTF）对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响。方法采用结扎大鼠左冠状动脉前降支30 min，然后松开再灌注2 h的方法，复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。实验分为假手术组、缺血再灌注组（IR），SSTF不同剂量治疗组。采用原位缺口末端标记法（TUNEL）及免疫组化法，检测心肌细胞凋亡指数（AI），Bax和Bcl-2基因蛋白表达。结果与假手术组比较，缺血再灌注组AI增加，Bax阳性表达增强，Bcl-2阳性表达减弱（P＜0.01）；与缺血再灌注组比较，SSTF组AI、 Bax阳性表达下降（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2阳性表达上调（P＜0.05或P＜0.01）。结论 SSTF能明显抑制IR引起的心肌细胞凋亡，其作用机制可能与下调Bax蛋白表达和上调Bcl-2蛋白表达，提高Bcl-2/Bax比值有一定关系。
       【关键词】  黄芩茎叶总黄酮 再灌注损伤 细胞凋亡 基因表达
       Effects of Total Flavonoid in  Scutellaria Baiculensis Stem-leaf on Myocyte Apoptosis and Expression of Apoptosis-associated Genes in Rat Hearts with Acute Myocardial Ischemia and Reperfusion
       GONG Mingyu，YU Xiao-min, ZHOU Xiaohui,YANG Hemei
       （Chengde Medical College,Chengde 067000,China）
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of total flavonoid(SSTF) in  Scutellaria Baiculensis Stem-leaf on myocyte apoptosis and the expression of apoptosis-associated genes in rat hearts with acute myocardial ischemia and reperfusion（IR）.MethodsThe left anterior descending branch of coronary artery was ligated for 30 min and reperfused for 2h to make a myocardial ischemia-reperfusion model in rats.The experiment rats were divided into five groups :sham, ischemia-reperfusion(IR),SSTF(17.5，35，70 mg·kg-1·d-1)group. Apoptosis index of(AI) of myocardium was detected by in situ end labeling method,and the protein expression of Bcl-2 and Bax genes cardiomyocytes was shown through immunohistochemistry method.ResultsIn IR group,AI was significantly increased , a protein expression of Bcl-2 gene was decreased and protein expression of Bax gene was increased.Compared with sham group,SSTF could decrease AI(P＜0.05，0.01)，up-regulate protein expression of Bcl-2 gene (P＜0.05，0.01)，and down- regulate protein expression of Bax gene (P＜0.05，0.01).ConclusionSSTF can significantly inhibit cardiomyocyte apoptosis in ischemia-reperfusion rat hearts.The possible mechanism is to raise the ratio of Bcl-2/Bax proteins by increasing  the expression of bcl-2 gene and decreasing the expression of bax gene.
       Key words：Total flavonoid in Scutellaria Baiculensis Stem-leaf；  Reperfusion injury；  Apoptosis ；  Gene expression
       
       近年来，研究发现细胞凋亡是心肌缺血再灌注过程中心肌细胞死亡的重要机制之一［1］。细胞凋亡的发生、发展受多种基因的调控，其中凋亡加速基因bax和凋亡抑制基因bcl-2被认为与细胞凋亡密切相关［2］。本实验观察大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡的发生情况，并探讨SSTF对心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡及凋亡相关基因bax和bcl-2表达的影响。
       1  材料与方法
       1.1  动物健康SD大鼠40只，体重（230±20）g，雌雄各半（由承德医学院实验动物中心提供）。
       1.2  药品、试剂及仪器SSTF纯度为61.8%，批号010608，由本院省重点实验室—中药研究所提供，用饱和NaHCO3溶解配置后灌胃。原位细胞凋亡检测试剂盒及Bax ，Bcl-2免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司产品。DB-3型心电图机，上海光电医用电子仪器有限公司；DW-2000型动物人工呼吸机，上海嘉鹏科技有限公司；RM-2155型石蜡切片机，瑞士LeiCa有限公司产品。
       1.3  大鼠心肌缺血再灌注模型的复制10%乌拉坦腹腔注射麻醉（1.0 mg/kg），仰卧位固定，用针型电极插入大鼠四肢皮下记录标准肢体II导联心电图，气管插管，接人工呼吸机，呼吸频率60 次/min，从胸骨左缘3～4肋间切开胸壁，切开心包膜后，暴露心脏，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2 mm处进针穿过心肌表层在肺动脉圆锥旁出针，将一段直径2 mm，长5 mm的硅胶管置于结扎线与心肌之间备用，稳定10 min后进行实验。
       1.4  实验分组40只SD大鼠随机分为5组：①假手术组（sham operation group,SO）：用3号丝线穿过冠状动脉左前降支，但不结扎。②心肌缺血再灌注组(Ischemia Reperfusion group,IR)：结扎冠状动脉左前降支，造成心肌缺血，30 min后剪断缝合线，取出硅胶管，再灌注2h，假手术组和心肌缺血再灌注组于术前分别给予相应容积的生理盐水，连用1周；③SSTF小剂量组(SSTFI组)：手术前给予SSTF灌胃17.5 mg·kg-1·d-1，连用1周，其余同②组。④SSTF中剂量组(SSTFII组)：手术前给予SSTF灌胃35 mg·kg-1·d-1，连用1周，其余同②组。⑤SSTF大剂量组(SSTFIII组)：手术前给予SSTF灌胃75 mg·kg-1·d-1，连用1周，其余同②组。
       
       再灌注2 h末，迅速剪下左冠状动脉前降支支配的左心室心肌，置于10%福尔马林中固定24 h，常规石蜡包埋、切片，做凋亡细胞、bax和bcl-2蛋白表达的检测。
       1.5  观测指标
       1.5.1  心肌细胞凋亡的原位检测按TUNEL试剂盒说明书进行标记染色，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕褐色。凋亡指数（Apoptosis Index,AI）的 确定：在光学显微镜下计数5个高倍视野（High power field,HRF，40×），先计数每个视野TUNEL阳性细胞数目和心肌细胞总数，以每个视野计算的阳性细胞数所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数，以5个视野的均值作为结果。
       1.5.2  bax和bcl-2蛋白表达的检测检测方法参照参考文献［3］在光学显微镜400×下，每张切片随机选取阳性细胞分布均匀的10个视野，用高清晰HAIPS-2000图像分析系统测量每组光密度平均值(OD值)。
       1.6  统计学分析采用SPSS10.0统计学软件。所有数值均用±s表示，多组间的比较用方差分析，两组间比较用q检验，P﹤0.05为差异有显著性。
       2  结果
       2.1  SSTF对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响光镜下TUNEL染色可见心肌阳性细胞的细胞核呈棕黄色，细胞轮廓清楚，正常细胞核呈蓝色，坏死区细胞结构模糊不清。细胞凋亡指数（AI）在假手术组、IR组、SSTFⅠ组、SSTFⅡ组、SSTFⅢ组分别为（1.65±0.8）% ，（16.4±2.13）% ，（15.1±2.01）%，（13.5±1.85）%，（12.2±1.56）%，可见缺血再灌注组和SSTF组的凋亡细胞数均比假手术组的多，凋亡指数均大于假手术组（P<0.01），IR组与SSTF组相比，前者的AI大于SSTFⅡ组、SSTFⅢ组（ P﹤0.05或P﹤0.01）。结果见表1 。
       2.2  SSTF对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡相关基因bax和bcl-2蛋白表达的影响阳性物质为棕黄色颗粒，Bcl-2蛋白主要分布在线粒体膜、内质网、核膜等处；Bax表达产物位于细胞浆或松散地附着在细胞膜上。与假手术组比较，缺血再灌注组Bax阳性表达增强，Bcl-2阳性表达减弱（P﹤0.01）；与缺血再灌注组比较，SSTF组 Bax阳性表达下降（P﹤0.05或P﹤0.01），Bcl-2阳性表达上调（P﹤0.05或P﹤0.01）。结果见表1。
       表1  SSTF对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡及凋亡相关基因bax和bcl-2蛋白表达的影响（略）
       与假手术组比较△P<0.05, △△P<0.01;与模型组比较,★P<0.05, ★★P<0.01;n=8
       3  讨论
          
       以往认为MIRI过程中，氧自由基水平升高，细胞内钙超载，细胞因子等是导致细胞凋亡的主要因素，但是这些因素并不直接引起细胞凋亡，而是通过一定的信号转导方式激活相关基因来调控细胞凋亡［4，5］。参与细胞凋亡调控的基因很多，其中 Bcl-2是调节凋亡基因家族的基本成员，Bcl-2是一种抑制细胞凋亡的基因，Bax基因与Bcl-2基因具有高度的同源序列，是促进细胞凋亡的基因［6，7］，Bcl-2和Bax二者形成了一个凋亡调控系统：①当Bax蛋白同源二聚体形成，便诱导细胞凋亡；②随Bcl-2蛋白表达量上升，越来越多的Bax蛋白二聚体分开，与Bcl-2形成比Bax-Bax更稳定的Bax-Bcl-2蛋白异源二聚体，从而“中和”了Bax-Bax诱导细胞凋亡的作用，细胞内Bcl-2与Bax的比例调节了凋亡的发生。因此，过度表达Bax蛋白可促进细胞凋亡并抑制 Bcl-2的抗凋亡作用。本研究结果显示，IR组AI显著高于SO组，且缺血再灌注使Bcl-2和Bax的表达明显增多，但以Bax的增多更为显著，使Bcl-2/Bax比值显著降低，提示Bcl-2和Bax确实参与了缺血再灌注时的心肌细胞凋亡调控。而在缺血再灌注前给予SSTF治疗，Bcl-2表达增加， Bax表达下降，Bcl-2/Bax比值升高，同时AI明显减少。由此推测，SSTF抑制心肌缺血再灌注引起细胞凋亡的机制可能与上调Bcl-2和下调Bax的蛋白表达，提高Bcl-2/Bax比值有一定关系。
       【参考文献】
         　　［1］ Xie Z,Koyama T,Suzuki J,et al.Coronary reperfusion followings ischemia:different expression of bcl-2 and bax proteins, and cardiomyocyte apoptosis［J］.Jpn Heart,2001,42(6)：759.
       
       ［2］ Yamamura T,Otani H,Nakao Y,et al . IGF-I differently regulates Bcl-xL and Bax and confers myocardial protection in the rat heart ［J］.Am J Physiol Heart Cire Physiol , 2001,280(3):HI191-HI200.
       
       ［3］ 阮长武，张代富，汪姗姗，等.黄芪对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响［J］.同济大学学报（医学版），2003，24(3)：182.
       
       ［4］ Vishna K, Steve E. Alterations in immunocyte tumor necrosis factor receptor and apoptosis in patients with congestive heart failure［J］.Ann Surg, 2002, 236(2)：254.
       
       ［5］ Scarabelli TM ,Stephanou A , Pasini E , et al .Different signaling pathways induce apoptosis in endothelial cells and cardiac myocytes during ischemia/reperfusion injury［J］.Circ Res , 2002, 90(6):745.
       
       ［6］ Brown R.The Bcl-2 family of proteins［J］.British Medical Bulletin,1997,53(3):466.
       
       ［7］ Reed JC.Double identity for proteins of the Bcl-2 family［J］.Nature,1997,387(6635):773.