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       【摘要】 
       目的研究金丝桃素及贯叶金丝桃中金丝桃素提取物对人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２ 的体外杀伤效应。方法通过测定胞内荧光强度以确定细胞对金丝桃素的吸收，用显微镜观察和ＭＴＴ 法研究金丝桃素及其提取物对细胞的生长抑制作用。结果光活化的金丝桃素对ＨｅｐＧ２ 细胞有显著的体外杀伤效应，其抑制细胞生长的能力与金丝桃素的浓度、给药与光照的时间间隔以及光照能量密切相关。结论金丝桃素及其提取物能明显抑制ＨｅｐＧ２ 细胞的生长，预示金丝桃素及其提取物在癌症治疗中有良好的开发研究前景。
       【关键词】  金丝桃素 光动力治疗 肝癌 发光二极管
       Photocytotoxic Effect of Hypericin and Extract in Hypericum performatum L．on HepG２ Cancer Cell Line of Human Liver in Vitro
       ＷＡＮＧ Ｘｉａｏｌｉ ， ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎｓｏｎｇ*， ＬＩＵ Ｊｉｎｃｈｕａｎ ， ＹＡＮＧ Ｒｕｄｅ
       （Shenzhen Polytechnic College，Shenzhen ５１８０５５， China； South China University of Science and Technology，Guangzhou５１０６４１， China）
       Abstract：ObjectiveＴｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔ ｉｎ Hypericum performatum Ｌ．ｏｎ ＨｅｐＧ２ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．MethodsTｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ was investigated in HepG2 cells ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｅｎｄｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ， ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ hｙｐｅｒｉｃｉｎ ａｎｄ the ｅｘｔｒａｃｔ ｂｙ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ＭＴＴ ａｓｓａｙ ．ResultsＬｉｇｈｔ －ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ ａｎｄ the ｅｘｔｒａｃｔ had ｏｂｖｉｏｕｓ killing ｅｆｆｅｃｔ ＨｅｐＧ ２ ｃｅｌｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ａｎｄ ｉｔｓ effects were ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ with ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ， ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ， ａｎｄ ａｌｓｏ ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｅｎｅｒｇｙ．ConclusionＨｙｐｅｒｉｃｉｎ ａｎｄ the ｅｘｔｒａｃｔ ｃａｎ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＨｅｐＧ２ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ．Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ ｉｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｎａｔｕｒａｌ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ ａｎｄ ｓｈｏｕｌｄ ｈａｖｅ ａ ｇｏｏｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ.
       Key words：Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ（ＨＹ）；  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ（ＰＤＴ）；  Ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ；  Ｌｉｇｈｔ －ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｄｉｏｄｅ （ＬＥＤ）
         
       金丝桃素（Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ，ＨＹ）是贯叶金丝桃Hypericum perforatum Ｌ．中的一种生物活性物质，结构为萘骈二蒽酮类化合物，是一种良好的光敏剂。研究表明，其具有抗抑郁、抗ＨＩＶ 及抗肿瘤等活性［１］ 。近年来，国外对金丝桃素在肿瘤的光动力治疗（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ，ＰＤＴ）方面的研究开发十分活跃，但国内未见有关贯叶金丝桃中金丝桃素提取物在抗肿瘤方面的报道。本实验研究了金丝桃素和贯叶金丝桃中金丝桃素提取物对肝癌ＨｅｐＧ２ 细胞的生长抑制及诱导凋亡的作用。
       １  材料
          
       人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２ 由国家生化工程技术开发中心提供；金丝桃素购于美国Ａｌｅｘｉｓ 公司，下简称ＨＹ，分子质量５０４．４５；贯叶金丝桃的金丝桃素提取物，下简称ＨＹ 提取物，由本实验室自制，经高效液相色谱分析金丝桃素的含量；ＲＰＭＩ －１６４０ 培养基为美国Ｇｉｂｃｏ 公司产品；小牛血清购于杭州四季青生物工程公司；胰酶－０．２５％ＥＤＴＡ 为美国Ｇｉｂｃｏ 公司产品；四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）购于北京鼎国生物技术有限责任公司；二甲亚砜（ＤＭＳＯ）为美国Ｓｉｇｍａ 公司产品；其余试剂为分析纯。
       
       Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ２ 型连续光谱光密度荧光检测仪（美国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ 公司），二氧化碳孵箱（德国Ｂｉｎｄｅｒ 公司），倒置荧光显微镜（德国Ｌｅｉｃａ 公司），光纤功率计（日本爱德万公司ＴＱ８２１０型），ＬＥＤ 光源（定制于深圳佳进光电技术有限公司），微孔板（美国Ｃｏｒｎｉｎｇ 公司）。
       ２  方法
       ２．１  细胞培养ＨｅｐＧ２ 细胞培养于含５％小牛血清、１００ Ｕ／ｍｌ 青霉素和１００ μｇ／ｍｌ 链霉素的ＲＰＭＩ －１６４０ 培养液中，３７℃，５％ＣＯ２ 及饱和湿度孵箱内单层贴壁生长。
       ２．２  细胞对金丝桃素的吸收实验对数生长期的细胞经消化制成细胞悬液，接种于９６ 孔细胞培养板上。培养至对数生长期后，吸去旧培养液，加入含ＨＹ 的培养液，ＨＹ 终浓度为１００ ｎｍｏｌ／Ｌ，使各实验组细胞分别与ＨＹ 共孵育０，０．５，１，２，４，６，８，２４ ｈ，吸去培养液，ＰＢＳ 漂洗２ 次，用Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ２ 型检测仪在Ｅｘ ＝４８５ ｎｍ，Ｅｍ ＝５９０ ｎｍ 条件下测细胞内荧光强度。
       ２．３  ＰＤＴ 程序在生长状况良好的细胞中，加入不同浓度（浓度以ＨＹ 计，预实验表明所用浓度在非光照情况下对细胞无毒性）的ＨＹ 提取物溶液或ＨＹ 溶液，对照组不加ＨＹ 溶液，加入相应体积的ＤＭＳＯ，其它处理方式与实验组相同。避光孵育一定时间后，将波长为５９０ ｎｍ 的黄色ＬＥＤ 光源置于培养板正上方，用ＴＱ８２１０ 型光纤功率计测得光源功率密度约１．０５ ｍＷ／ｃｍ２ ，分别照射３０，６０，９０ ｍｉｎ，积累能量为３．７８，７．５４，１１．３ Ｊ／ｃｍ２ 。ＰＤＴ 后避光培养２４ ｈ 后，进行细胞形态观察，并用ＭＴＴ 法测定细胞生长抑制情况。
       ２．４  ＭＴＴ 法测定体外细胞毒作用将待检测的细胞弃去培养液，加入含ＭＴＴ ０．５ ｍｇ／ｍｌ 的无血清培养液１００ μｌ，继续培养４ ｈ后，吸出各孔液体，加入含０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ 的异丙醇１００ μｌ，振荡溶解１５ ｍｉｎ，测定波长５７０ ｎｍ 下的各孔吸光值（OD５７０ ），计算细胞的生长抑制率［２］ ：
       
       生长抑制率（％） ＝（１ －实验组平均OD５７０值／对照组平均OD５７０ 值） ×１００
       
       绘制ＨＹ 浓度－生长抑制率曲线。
       ２．５  统计学分析用ＳＰＳＳ１０．０ 统计软件进行统计分析。
       ３  结果
       ３．１  细胞对金丝桃素的吸收曲线图１ 为细胞对ＨＹ 的吸收曲线。显示了给药后不同时间细胞内的荧光强度，测定了相对荧光值（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ，ＲＦＵ），其反映了细胞摄入的ＨＹ量，可见胞内的ＨＹ 含量在给药６ ｈ 后趋于饱和。
       图1  HepG2细胞对HY的吸收曲线（略）
       ３．２  细胞的形态学变化正常情况下的ＨｅｐＧ２ 细胞呈梭形或多角形，轮廓清晰，生长旺盛，偶见漂浮细胞。当加入不同浓度的ＨＹ 溶液并加以适当的光照后，细胞可产生不同的形态变化，其效果与ＨＹ 的浓度及光照时间呈明显的正相关性。以光照６０ｍｉｎ 为例，当ＨＹ 浓度≤１００ ｎｍｏｌ／Ｌ，细胞的死亡形式主要为凋亡，表现为细胞从瓶壁上脱落，逐渐变为圆形，悬浮细胞增多，胞质浓缩，细胞体变小；而当ＨＹ 浓度为５００ ｎｍｏｌ／Ｌ 时，细胞的死亡形式主要为直接坏死，表现为细胞膜通透性增高，细胞肿胀、细胞器变形或胀大，最后细胞溶解破裂。
       ３．３  ＨＹ 及ＨＹ 提取物的细胞毒作用
       ３．３．１  ＨＹ 浓度不同的提取物和给药后不同时间光照的细胞毒作用图２ 为分别为不同浓度的ＨＹ 提取物在给药后１ ｈ 和６ ｈ光照６０ ｍｉｎ 的细胞生长抑制曲线。ＨＹ 的浓度分别为１０，３０，５０，８０，１００ ｎｍｏｌ／Ｌ。结果表明，ＨＹ 提取物的浓度与细胞生长抑制率基本呈正相关，且给药后６ ｈ 光照比给药后１ ｈ 光照的生长抑制效果好，P ＜０．０５，具有显著差异。
       图2  给药后孵育不同时间后光照60 min的抑制曲线（略）
       ３．３．２  ＨＹ 浓度不同的提取物在不同光照时间下的细胞毒作用图３ 为给药后６ ｈ 分别光照３０，６０，９０ ｍｉｎ 的细胞生长抑制曲线。ＨＹ 的浓度分别为１０，３０，５０，８０，１００ ｎｍｏｌ／Ｌ。结果表明，ＨＹ 的光动活性与ＨＹ 的浓度及光照的时间基本呈正相关性。与对照组比较，P 值均＜０．０５，具有显著差异。
       图3  给药后6 h光照不同时间的抑制曲线（略）
       ３．３．３  　ＨＹ 与ＨＹ 提取物的细胞毒作用比较图４ 比较了ＨＹ 与ＨＹ 提取物对ＨｅｐＧ２ 细胞的抑制作用。ＨＹ 的浓度分别为１０，３０，５０，８０，１００ ｎｍｏｌ／Ｌ。结果表明，ＨＹ 提取物具有更大的细胞生长抑制活性，P ＜０．０５，具有显著差异。
       图4  HY和HY提取物抑制HepG2细胞生长的活性比较（略）
       ４  讨论
          
       肿瘤的ＰＤＴ 疗法主要是基于光敏剂对肿瘤细胞与正常细胞有不同的亲和性，使光敏剂的光生化反应选择性地在肿瘤组织内进行，从而起到杀死肿瘤细胞的作用［３］ 。ＨＹ 是一种研究中的新型光敏剂，在各种肿瘤治疗的研究中均表现出了良好的光动活性，是一种很有潜力的新型抗癌药物［４］ 。本实验以金丝桃素和贯叶金丝桃中提取的ＨＹ 提取物为光敏剂，研究了其对肝癌细胞ＨｅｐＧ２ 的体外杀伤效应。实验证明，ＨＹ 极易在ＨｅｐＧ２ 细胞内积累，在荧光显微镜下可见强烈的橘红色荧光，其荧光强度随细胞内ＨＹ 量的增加而增加，给药６ ｈ 后即可达到饱和。给药后６ ｈ比给药后１ ｈ 进行ＰＤＴ 的效果明显要好，说明ＨＹ 的抗肿瘤效果显然与细胞内的ＨＹ 积累量有关，也预示着ＰＤＴ 过程产生的活性物质，如活性氧系ＲＯＳ［４］ 的寿命非常短暂，光照时只有已进入细胞内的ＨＹ 才能对肿瘤细胞产生细胞毒作用。ＨＹ 对肿瘤细胞的细胞毒作用有诱导凋亡与坏死两种模式，这两种模式的转化是一定浓度的ＨＹ 和光照能量等多种因素相互作用的结果，一般在较低的ＨＹ 浓度和光照能量作用下以诱导凋亡为主。
       
       本实验还将ＨＹ 提取物与ＨＹ 进行了药效比较，结果显示ＨＹ 提取物具有更好的抗肿瘤作用，预示着提取物中可能还有其它成分与ＨＹ 一起协同发挥了抗肿瘤的功效，这与众多文献报道一致［５ ～７］ 。由于金丝桃素的提取纯化工艺复杂，高纯度金丝桃素制品非常昂贵，大大限制了其在临床上的应用。从现有的实验结果看，在进行肿瘤的光动力治疗时，可能并不需要高纯度的金丝桃素作光敏剂，仅用提取物就能达到疗效，这将大大降低治疗成本，产生巨大的社会效应。
       
       光源也是制约ＰＤＴ 疗法广泛应用的另一大因素。目前ＰＤＴ治疗中一般都采用激光器作为光源，但激光器目前可供选择的波长有限，不易与所用光敏剂的最大吸收波长相配合，而且激光光束细小，不适合作大面积的照射，且治疗成本较高，限制了ＰＤＴ疗法的应用。ＬＥＤ 光源是一种具有广阔发展前景的新型光源，其光谱峰的半宽最窄已可达到十几纳米以下，可选择的波长范围已覆盖了整个可见光区，其在发光强度、波长与价格方面与激光器相比表现出更多优势。现有的ＬＥＤ 可以满足一般的临床低强度治疗的需要［８］ 。美国研究人员用ＬＥＤ 光源进行脑肿瘤光动力治疗的临床试验也取得了良好效果，所用光源的机械性能比激光和其他光源更为可靠。本实验所采用的黄色ＬＥＤ 光源，主波长为５９０ ｎｍ，与金丝桃素的最大吸收波长正好相符，用该光源进行金丝桃素的体外抗肿瘤实验取得了良好的效果。可见，ＬＥＤ 是一种很有潜力替代激光器进行肿瘤光动力治疗的光源。
       
       肝癌是发病率和死亡率都极高的癌症，传统治疗方法如手术切除、放疗及化疗等不仅使病人遭受巨大的身心创伤，且预后较差。光动力疗法（ＰＤＴ）是近20年来兴起并不断发展的治疗恶性肿瘤的新技术，近年来在肝癌治疗方面推出了超声引导经皮介入ＰＤＴ 治疗法，可实现肝肿瘤的大体积灭活，安全有效，而且创伤小，恢复快，易为患者所接受［９］ 。相信随着光纤技术的发展和对ＨＹ 抗肿瘤作用的深入研究，ＨＹ －ＰＤＴ 疗法有望成为肝癌治疗的新方法。
       【参考文献】
         　　［1］ 梁巧丽，高宏成．金丝桃素研究进展［Ｊ］．中草药，１９９９，３０（９）：７０５．
       
       ［2］ 刘兴吉，鞠 砚，孟 艳，等．光活化的金丝桃素诱导胶质瘤细胞凋亡的实验研究［Ｊ］．中国实验诊断学，２００１，５（１）：２９．
       
       ［3］ 王 勇，李正佳，朱长虹．一种高功率红光光动力治疗激光器系统［Ｊ］．激光杂志，２００３，２４（５）：８１．
       
       ［4］ Ｐａｔｒｉｚｉａ Ａｇｏｓｔｉｎｉｓ， Ａｎｎｅｌｉｅｓ Ｖａｎｔｉｅｇｈｅｍａ， Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍｅｒｌｅｖｅｄｅ， ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： ｍｏｒｅ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ｔｈｅ ｗａｙ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，３４：２２１．
       
       ［5］ Ｒｏｓｃｅｔｔｉ Ｇ， Ｆｒａｎｚｅｓｅ Ｏ， Ｃｏｍａｎｄｉｎｉ Ａ， ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ Ｌ． ｏｎ Ｋ５６２ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ： ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００４， １８ （１）：６６．
       
       ［6］ Ｈｏｓｔａｎｓｋａ Ｋ， Ｒｅｉｃｈｌｉｎｇ Ｊ， Ｂｏｍｍｅｒ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ａｑｕｅｏｕｓ ｅｔｈａｎｏｌｉｃ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｓｔ．Ｊｏｈｎ＇ｓ ｗｏｒｔ （Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ Ｌ．） ｉｎｄｕｃｅｓ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ［ Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，２００２， ５７（５）：３２３．
       
       ［7］ Ｈｏｓｔａｎｓｋａ Ｋ， Ｂｏｍｍｅｒ Ｓ， Ｗｅｂｅｒ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ －ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ Ｌ．ｅｘｔｒａｃｔｓ， ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌｓ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ， ｏｎ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２００３， ５５（７）：９７３．
       
       ［8］ 刘 江，范广涵，刘承宜．改进实用型ＬＥＤ 生物光源系列［Ｊ］．应用激光，２００３，２３（３）：１４７．
       
       ［9］ 杨 栋．肿瘤光动力学治疗研究进展［ Ｊ］．应用激光，２００３，２３（６）：３７８．