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       【摘要】 
       目的建立化学发光新方法以考察黃酮等物质对超氧自由基的清除作用。方法以碱性条件下邻苯三酚自氧化作为超氧阴离子的产生体系，以化学发光的降低作为检测活力的指标。结果杭白菊、马齿苋、槲皮素、芦丁都表现出对超氧阴离子自由基的清除作用。结论该方法简单、快速，可用于中草药抗氧化活性研究。
       【关键词】  化学发光法 黃酮 超氧阴离子自由基
       The Scavenging Effect of Flavonoids etc．on Superoxide Radicals with Flow －injection Chemiluminescent Method
       ＺＨＡＯ Ｆａｎｇ， ＤＵ Ｚｈｉｊｉａｎ，  ＢＩＡＮ Ｌｉ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉｎｇ
       （College of Chemistry and Chemical Engineering，Shihezi University， Shihezi ８３２０００，China）
       Abstract：ObjectiveＴｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｅｃｔ ．ｏｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ．MethodsＲｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｗｏｒｋｅｄ ａｓ ａｎ ｉｎｄｅｘ ｗｉｔｈ ｐｙｒｏｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｌｆ －ｏｘｉｄｅ ｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｍｅｄｉｕｍ．ResultsＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ，ｐｕｒｓｌａｎｅ ｈｅｒｂ，ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ，ｒｕｔｉｎ ｓｈｏｗｅｄ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ．ConclusionＴｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｑｕｉｃｋ．Ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ．
       Key words：Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；  Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ
       
       生命活动的有氧代谢可以不断产生各种自由基，超氧阴离子自由基Ｏ－２ · 是其中３ 种有代表性的自由基（超氧阴离子自由基Ｏ－２ · 、羟基自由基ＯＨ· 、酯自由基ＲＣＯＯ· ）之一。［１］ 过剩的超氧阴离子自由基Ｏ－２ · 对生物细胞有巨大的破坏作用，是引起人体衰老和导致癌症、冠心病、动脉硬化等多种疾病诱因之一。清除生物体内过剩自由基，寻找能够清除活性氧自由基的抗氧化剂已成为医学和生物学领域一项重要研究课题。目前常用的自由基检测方法有：电子自旋共振法［２］ 、电化学法［３］ 、毛细管电泳法、荧光光谱法、光度法、色谱法等［４］ 。这些方法存在仪器昂贵、操作复杂、选择性差或灵敏度低等缺点。与之相比，流动注射化学发光法具有灵敏、快速、操作简单、重现性好等优点，近年来常用于自由基抗氧化剂的研究和筛选。本研究基于碱性条件下，邻苯三酚自氧化产生Ｏ－２ · 自由基，氧化肾上腺素产生化学发光的现象，建立了检测超氧阴离子自由基新体系，并成功应用于黃酮等物质对超氧阴离子清除能力的检测。
       １  仪器与材料
          
       化学发光仪（中国科学院生物物理研究所）；恒流泵（上海青浦）；ＢＳ１２４Ｓ 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；ＰＨＳ－３Ｃ 精密ｐＨ 计（上海精密科学仪器有限公司）。
       
       邻苯三酚储备液：以１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ 配制成０．１ ｍｏｌ／Ｌ 溶液，贮于冰箱，临用前稀释；盐酸肾上腺素标准品（中国药品生物制品检定所）：１．０ ×１０ －３ ｇ／ｍｌ，用重蒸水配制于棕色容量瓶中，贮于冰箱，临用前稀释；０．１ｍｏｌ Ｎａ２ ＣＯ３ －ＮａＨＣＯ３ 缓冲液；所有试剂均为分析纯，水为重蒸水。芦丁（生化试剂，上海试剂二厂）、槲皮素（Ｆｌｕｋａ 公司产品）储备液：各准确称取０．５ ｍｇ，分别用少量甲醇溶解后，二次蒸馏水定容于５０ ｍｌ 容量瓶待用。
       ２  方法
       ２．１  样品中黃酮类物质的提取及试样制备干杭白菊（购于市场）→粉碎→１０ 倍量９５％乙醇浸泡１ ｈ，回流提取２ 次，每次９０ｍｉｎ→残渣用９５％乙醇洗至无色，合并滤液→减压浓缩→乙醇提取物。马齿苋（自采）→干燥粉碎→石油醚（６０ ～９０℃）脱脂两次（每次１ ｈ）→弃石油醚提取液→挥干浸膏石油醚→１０ 倍量９５％乙醇回流提取两次，每次１ ｈ→合并滤液→减压浓缩→乙醇提取物。
       ２．２  超氧阴离子自由基Ｏ－２ · 检测方法如图１ 所示，分别将邻苯三酚、缓冲溶液和肾上腺素通过相应管道泵入分析系统，邻苯三酚、缓冲液和肾上腺素混合后产生化学发光信号，待信号稳定后，注入清除剂，以相对峰高计算发光抑制率。
       P.蠕动泵  V.阀  F.流通池  W.废液  D.检测器  PC.计算机
       图1  流动注射化学发光仪示意图（略）
       ２．３  清除剂检测原理发光体系信号稳定后，依次泵入不同浓度的自由基清除剂，每个浓度测定３ 次，取平均值，以空白对照的发光强度为１００％，注入清除剂后发光强度下降，发光抑制百分率用以下公式计算：
       
       抑制百分率（%）＝空白对照峰高样品峰高空白对照峰高×１００％
       3  结果与讨论
       ３．１  　超氧阴离子自由基Ｏ－２ · 检测体系的优化
       ３．１．１  邻苯三酚浓度的优化在碱性介质中，邻苯三酚自氧化产生超氧阴离子自由基Ｏ－２· ，对其浓度的选择是至关重要的。本研究考察了１．０ ×１０ －２ ～１．０ ×１０ －６ ｍｏｌ／Ｌ 范围内不同浓度的邻苯三酚对发光强度的影响。实验结果表明，当邻苯三酚浓度超过５．０ ×１０ －４ ｍｏｌ／Ｌ 时，发光强度呈下降趋势，且实验重复性降低，故本研究选择邻苯三酚的浓度为５．０ ×１０ －４ ｍｏｌ／Ｌ。
       ３．１．２  肾上腺素浓度的影响考察了１．０ ×１０ －３ ～１．０ ×１０－６  ｇ／ｍｌ 肾上腺素对体系化学发光强度的影响，发现发光强度随肾上腺素浓度的增加而增加。当肾上腺素浓度达到２．０ ×１０ －５ ｇ／ｍｌ后，继续增大肾上腺素浓度，发光强度降低，本研究选用２．０ ×１０ －５ ｇ／ｍｌ 肾上腺素。
       ３．１．３  缓冲溶液及ｐＨ 值的影响考察了同浓度的ＫＨ２ ＰＯ４ －Ｎａ２ ＨＰＯ４ ，ＮＨ３ －ＮＨ４ Ｃｌ，Ｔｒｉｓ －ＨＣｌ，ＨＡｃ －ＮａＡｃ，硼砂，Ｎａ２ ＣＯ３ －ＮａＨＣＯ３ 缓冲溶液对体系发光强度的影响，结果表明在ＮａＨＣＯ３ －Ｎａ２ ＣＯ３ 缓冲溶液中体系的发光信噪比最大。同时实验了ｐＨ在８．０ ～１２．０ 范围内不同ｐＨ 值对发光强度的影响，发现随ｐＨ值增大，发光强度增大。考虑到邻苯三酚自氧化速率和体系发光的稳定性，本研究选用ｐＨ 为１０．１０。
       ３．２  槲皮素、芦丁标准溶液清除Ｏ－２ · 的作用分别取槲皮素、芦丁标准品储备液用ｐＨ 为１０．１０ 的Ｎａ２ ＣＯ３ －ＮａＨＣＯ３缓冲液配制成０，０．４，１．２，２．４， ３．６，４．８，６．０，７．２ μｇ／ｍｌ，在上述选定的条件下，测其发光强度，计算抑制率。以发光抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标作图，以发光抑制率５０％时对应浓度比较不同样品清除Ｏ－２· 能力大小。结果见图２。
       
       由图２ 可知，抑制率为５０％时，芦丁的浓度小于槲皮素浓度，说明芦丁对Ｏ－２ · 清除作用大于槲皮素。
       ３．３  杭白菊、马齿苋提取物对Ｏ－２ · 的清除作用将杭白菊、马齿苋提取物临用前用缓冲液配制成系列梯度浓度，依次注入发光体系，测其发光强度。杭白菊、马齿苋提取物浓度与发光强度呈线性关系，抑制率（Y） 与提取物浓度（C）的线性方程及发光抑制率５０％的样品浓度（ＩＣ５０ ）见表１。
       图2  发光抑制率与浓度的关系（略）
       表1  杭白菊、马齿苋提取物对O-2·的清除作用（略）
       综上，通过对发光体系条件优化，检测了芦丁、槲皮素、杭白菊、马齿苋提取物对Ｏ－２ · 的清除能力，为抗氧化剂筛选及评价提供了依据。
       【参考文献】
         　　［1］ 穆光照．自由基反应［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９８５：１．
       
       ［2］ 成喜雨，崔 馨，刘春朝，等．中草药抗氧化活性研究进展［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００６，１８（１０）：５１４．
       
       ［3］ Ｒｈｏｄｅｓ ＣＪ，Ｔｒａｎ ＴＴ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｈ．Ａ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｆｆｉｃｅｎ ｃｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＥＳＲ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍ Ａｃｔａ ｐａｒｔ Ａ， ２００４，６０：１４０１．
       
       ［4］ 郑国灿，肖尚友，穆小静，等．自由基检测技术进展［Ｊ］．广州化学，２００６，３１（３）：３７．