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       【摘要】 
       目的筛选水曲柳总香豆素的最佳提取工艺。方法采用正交实验设计Ｌ９ （３４ ）考察浸渍时间，乙醇浓度，水浴温度，提取时间４ 个因素对提取工艺的影响。结果水曲柳中总香豆素含量的最佳工艺为水曲柳粗粉加２５ 倍量９５％乙醇， 室温超声提取４５ ｍｉｎ。结论优选的超声提取条件工艺简单，成本低，节能省时，可增加水曲柳的利用率。
       【关键词】  水曲柳 白蜡树精 正交实验 总香豆素
       Technological Research on Extracting Coumarins from Fraxinus mandschurica Rupr ．
       ＣＨＥＮ Ｙｕｊｕａｎ， ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇｇｕｉ*， ＳＵＮ Ｙａｎｔｏｎｇ, ＷＡＮＧ Ｈｕｉｔａｎｇ ， ＨＥ Ｌｉｐｅｎｇ ， ＭＵ Ｘｕｐｅｎｇ
       （Pharmaceutical College， Jilin University， Changchun １３００２１， China； College of Traditional Chinese Materia Medica， Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing， １００１０２， China； College of Life Science， Changchun University of Science and Technology， Changchun １３００２２， China； Changchun Institute of Applied Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Changchun １３００２２， China）
       Abstract:ObjectiveＴｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｕｍａｒｉｎｓ ｆｒｏｍ Fraxinus mandschurica Rupr．ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ．MethodsＡｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ Ｌ９ （３４ ），ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ： ｓｏａｋｉｎｇ ｔｉｍｅ，ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｗａｔｅｒ －ｂａｔｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｔｉｍｅ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．ResultsＴｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２５ －ｆｏｌｄ ９５％ｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒ ４５ｍｉｎｕｔｅｓ ｕｎｄｅｒ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．ConclusionＴｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｉｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｕｍａｒｉｎｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Fraxinus mandschurica Rupr．
       Key words:Fraxinus mandschurica Rupr；　Ｆｒａｘｉｎｏｌ；　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ；　Ｃｏｕｍａｒｉｎｓ
       
       水曲柳Fraxinus mandschurica Ｒｕｐｒ．是一种落叶乔木，高度可达３０ ｍ，直径超过１ ｍ，主要分布于我国大兴安岭东部和小兴安岭、长白山等地。水曲柳为优质木材，但水曲柳皮却没有被充分开发利用，只在民间作为抗风湿的偏方使用（文献记载可做秦皮代用品［１］ ），其化学成分国外有见报道，国内很少有人研究，其药效价值还有待开发。已发现其树皮跟同属植物一样主要含有香豆素类成分，现已发现的香豆素类有秦皮甲素（Ｅｓｃｕｌｉｎ），秦皮乙素（Ｅｓｃｕｌｅｔｉｎ）， 秦皮苷（Ｆｒａｘｉｎ）， 异秦皮定（Ｉｓｏｆｒａｘｉｄｉｎ）， 白蜡树精（Ｍａｎｄｓｈｕｒｉｎ， Ｆｒａｘｉｎｏｌ ）［２，３］ 。研究其香豆素类成分对水曲柳皮的开发利用以及防治病虫害都有意义。
       1  仪器与材料
       １．1  仪器７２２ 型光栅分光光度计（山东高密彩虹分析仪器有限公司），梅特勒ＡＢ１３５ －Ｓ 十万分之一天平（德国），ＨＨ －４２ 快速恒温数显水箱（常州国华电器有限公司）。
       １．2  试药水曲柳采自长白山，经吉林大学药学院张静敏教授鉴定为水曲柳Fraxinus mandschurica Ｒｕｐｒ．；标准品白蜡树精（自制），经过１ Ｈ －ＮＭＲ，１３ Ｃ －ＮＭＲ 鉴定，ＨＰＬＣ 峰面积归一化法测定其含量达９８％以上；其它试剂为分析纯。
       2  方法与结果
       ２．１  标准曲线的绘制精密称取白蜡树精对照品，置于５０ ｍｌ容量瓶中，加入适量甲醇溶解并定容至刻度，配制成含白蜡树精０．１ ｍｇ／ｍｌ 的原对照品溶液。精密吸取对照品溶液适量，加甲醇定容至５０ ｍｌ，配制成含白蜡树精分别为８，１６，２４，３２，４０ μｇ／ｍｌ的对照品系列溶液。于３３４ ｎｍ 处测定吸收度，并以吸光度与对照品浓度进行回归，得标准曲线方程Y ＝０．０３６X －０．０２１ ９，r ＝０．９９９ ７（n＝５）。实验表明白蜡树精在８ ～４０ μｇ／ｍｌ 浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。
       ２．２  精密度实验精密吸取上述原对照品溶液适量２ ｍｌ，加甲醇稀释至１０ ｍｌ，于３３４ ｎｍ 处测定吸光度，连续６ 次，结果表明６次测定的RSD 为０．５４％，故仪器精密度良好。
       ２．３  稳定性实验将精密度实验项下的对照品溶液于０，１，２，４，６，８ ｈ 在３３４ ｎｍ 处测定吸光度，实验结果表明RSD＝０．９３％，对照品溶液在８ ｈ 内稳定性良好。
       ２．４  重现性实验取水曲柳皮粗粉６ 份各２ ｇ，精密称定后置于５０ ｍｌ 容量瓶中，加甲醇至刻度线，超声３０ ｍｉｎ，过滤，取滤液稀释２０ 倍后分别于３３４ ｎｍ 处测定吸光度，并计算其含量，实验结果６个样品含量RSD＝１．５７％，表明本法重现性良好。
       ２．５  加样回收率实验取已知重现性实验项下的６ 份样品中的任意一份，精密吸取１ ｍｌ，稀释２０ 倍后，准确加入一定量的对照品溶液，混匀，在３３４ ｎｍ 处测定吸光度，计算白蜡树精的平均加样回收率为９８．２％，RSD＝２．０７％（n＝６）。
       ２．6  正交实验设计优化以水曲柳中总香豆素为考察指标，选择超声提取工艺中４ 个主要影响因素：浸渍时间（Ａ），乙醇浓度（Ｂ），水浴温度（Ｃ），提取时间（Ｄ）进行优化提取水曲柳中香豆素的条件。研究方法采用正交设计，每个因素选择３ 个水平，以Ｌ９（３４ ）正交表安排实验，具体影响因素及实验水平见表１。
       表1  因素水平（略）
       每一实验号取水曲柳皮粗粉２．０ ｇ，精密称定后置于５０ ｍｌ容量瓶中，加甲醇至刻度线，按要求浸渍一定时间后在设定的水浴温度下进行超声提取，取出冷却至室温，过滤，取滤液稀释２０倍后进行测定，各实验号平行操作重复３ 次。结果见表２。
       
       由表２ 极差Ｒ 比较可知，影响水曲柳总香豆素提取的因素主次顺序为Ｂ ＞Ｄ ＞Ａ ＞Ｃ，即乙醇浓度最重要，超声时间次之。按表２ 的Ｋ 值直观分析， 得出超声提取最佳工艺组合为Ｂ３ Ｄ３ Ａ２ Ｃ３ 。进一步经方差分析表明乙醇浓度和超声提取时间均对总香豆素的提取具有非常显著性差异。
       表2   L9（34）正交实验设计及结果分析（略）
       3  讨论
          
       由于水曲柳中的秦皮乙素与秦皮甲素的含量相对较低，但白蜡树精的化学性质稳定，所以本实验选择白蜡树精为对照品考察检测条件的可行性。游离香豆素能溶于沸水，难溶于冷水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等溶剂；香豆素苷类能溶于水、甲醇、乙醇，而难溶于乙醚、苯等极性小的溶剂［４］。考虑对总香豆素的溶解与溶剂的毒性，本实验选择乙醇作为提取水曲柳中总香豆素的溶剂。
       
       通过正交实验设计及方差分析，表明乙醇浓度和超声提取时间均对总香豆素的提取具有非常显著性差异，而水浴温度与浸渍时间没有显著性差异，结合实际条件，优选出水曲柳皮总香豆素的最佳提取工艺为水曲柳粗粉加２５ 倍量９５％乙醇，室温超声提取４５ ｍｉｎ。实验过程中发现水曲柳皮中含有较多的糖，所以选择９５％的乙醇既能提高总香豆素的提取率，又能降低糖的溶解度， 有利于香豆素成分的进一步纯化和分离。该提取工艺简单，成本低，节能省时，对研究水曲柳的提取分离具有一定的参考价值。
       【参考文献】
         　　［1］ 严仲铠，李万林．中国长白山药用植物彩色图谱［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，１９９７：３３９．
       
       ［2］ Ｒｅｐｐｅｌ Ｌ．Ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｕｍａｒｉｎｓ， Ｐｈａｒｍａｚｉｅ［Ｊ］．１９５４， ９：２７８．.
       
       ［3］ Ｍ．Ｖ．Ａｒｔｅｍ＇ｅｖａ， Ｇ．Ｋ．Ｎｉｋｏｎｏｖ ａｎｄ Ｍ．Ｏ．Ｋａｒｒｙｅｖ．Ｃｏｕｍａｒｉｎｓ ｏｆ Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｍａｎｄｓｃｈｕｒｉｃａ ａｎｄ Ｆ．ｐｏｔａｍｏｐｈｉｌａ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，１９７５， ９（４）：４６５．
       
       ［4］ 肖崇厚．中药化学［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，２００２：２２７．