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       【摘要】 
       目的研究五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌生物膜的影响。方法采用试管对倍稀释法测定五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌的最小抑菌浓度（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ＭＩＣ）。采用平板改良体外复制假单胞铜绿杆菌生物膜模型，并检测五倍子醇提液的不同ＭＩＣ 浓度对假单胞铜绿杆菌生物膜的影响作用。结果五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌的ＭＩＣ 为３１．２５ ｍｇ／ｍｌ，１．５ 倍的ＭＩＣ（４６．８ ｍｇ／ｍｌ）能使生物膜活菌数明显减少，但不能完全清除生物膜上的细菌，２ 倍的ＭＩＣ（６２．５ ｍｇ／ｍｌ）对细菌生物膜有完全清除作用。结论五倍子对铜绿假单胞菌生物膜有清除效应，但还需要进行临床用药研究。
       【关键词】  五倍子醇提液 假单胞铜绿杆菌 细菌生物膜
       Effects of the Ethanol －Extract of Galla Chinensis on Psedomonas aeruginosa Biofilm
       
       HUANG Xiaomin, JIAN Runhao, YU Xiaoling, ZENG Suihong, JIAN Xiaohuan, HUANG Weixiong, WU Zhongxing
       (Yingdong College of Bioengineering， Shaoguan University, Shaoguan, Guangdong ５１２００５， China）
       Abstract：ObjectiveＴｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ －ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｇ.cｈｉｎｅｎｓｉｓ ｏｎ P．aeruginosa Ｂｉｏｆｉｌｍ ．MethodsＭｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ＭＩＣ） ｗas ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｄｏｕｂｌe ｄｉｌｕｔｉｏｎ， ａｎｄ P．aeruginosa bｉｏｆｉｌｍ was induced ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂｒｏｗｎｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ －ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｇ．Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＭＩＣ ｏｎ P．aeruginosa bｉｏｆｉｌｍ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ．ResultsＴｈｅ ＭＩＣ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ －ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｇ ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｔｏ Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｗａｓ ３１．２５ｍｇ／ｍｌ， １．５ＭＩＣ（４６．８ｍｇ／ｍｌ） ｏｆ Ｇａｌｌａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ coulde ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ P．aeruginosa bｉｏｆｉｌｍ， ａｎｄ ２ＭＩＣ （６２．５ ｍｇ／ｍｌ） had ｔｈｅ eliminating effect ｏｎ ｉｔ．ConclusionＧａｌｌａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｈａｓ ｔｈｅ eliminating effect ｏｎ P．aeruginosa Ｂｉｏｆｉｌｍ， ｗｈｉｃｈ ｓｔｉｌｌ ｎｅｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．
       Key words：Ｅｔｈａｎｏｌ －ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｇａｌｌａ．Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ；  P ．aeruginosa；  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍ
       
       五倍子（Ｇａｌｌａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）为植物漆树科盐肤木Rhus chinensis Ｍｉｌｌ，青麸杨R．potaninii Ｍａｘｉｍ．或红麸杨R．punjabensis Ｓｔｅ Ｗ．ｖａｒ．sinica Ｒｅｈｄ．ｅｔ Ｗｉｌｓ．等的叶或叶柄上受倍蚜虫刺伤寄生的虫瘿，产于四川、贵州、云南等地。秋季采收，煮死虫瘿内部寄生虫，晒干，生用。五倍子明确的抑菌或杀菌作用已有较多报道［１］ ，但五倍子对细菌生物膜影响的相关报道却不多见。
       
       细菌生物膜（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍ， ＢＦ）是细菌抵抗不利环境，营造合适的微生环境，以利于生存的一种黏附定植式群体生存方式。ＢＦ 现象不仅是近年来逐渐受到重视的细菌生物学特性，而且与许多慢性难治性细菌感染及医院内感染密切相关。研究表明，假单胞铜绿杆菌是临床产生ＢＦ 相关感染最常见的条件致病菌，由于假单胞铜绿杆菌ＢＦ 的形成，抗菌药物难于渗透，导致抗生素治疗时间长，细菌易产生耐药，造成临床上某些难治性感染（如获得性肺炎及慢性呼吸道感染等） ［２］ 。目前国际和国内对假单胞铜绿杆菌的生物膜抑制作用主要致力于抗生素的研究，本实验主要探讨五倍子醇提液在体外对假单胞铜绿杆菌生物膜的影响，为临床用药提供参考。
       1  器材与方法
       1.1  样品来源①试验样品：五倍子为烤干生药，由广东省粤北医院中药房提供。②样品配制：以４０ ｇ 生药与２００ ｍｌ ９５％乙醇的比例配合，并采用乙醇回流提取法，加热回流提取３ 次，每次用９５％乙醇２００ ｍｌ，过滤，合并提取液，减压回收乙醇［３］ ，调整药物浓度为１００ ｍｌ 药液含生药２０ ｇ，调节ｐＨ 为７．４，０．０８ ＭＰａ 的蒸气压１００℃的温度灭菌１５ ｍｉｎ 备用。
       1.2  菌株来源及其试剂①黏液型铜绿假单胞菌临床分离株，来源于广东省韶关市第一人民医院检验科，经本学院微生物学实验室ＴＤＲ －２００Ｂ 全自动型微生物分析仪检测鉴定证实。②质控菌株：P．aeruginosa ＡＴＣＣ ２７８５３，来源于中国药品生物制品检定所。③菌株培养：受试菌培养采用大豆胰酶肉汤（Ｌｕｒｉａ －Ｂｅｒｔａｎｉ Ｍｅｄｉｕｍ，ＬＢ 肉汤），ＬＢ 琼脂平板，ｐＨ ７．４ 磷酸盐缓冲溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＰＢＳ）等均为本实验室配制。④实验用高分子滤膜为０．２ μｍ 孔径，由Ｇｅｌｍａｎ 公司提供。
       1.3  仪器ＴＤＲ －２００Ｂ 全自动型微生物分析仪（长沙天地人生物科技有限公司），旋涡混合器（北京同正技术发展公司），７２１ 分光光度计（上海第三分析仪器厂），麦氏比浊仪（法国ｂｉｏ －Ｍｅｒｉｅｕｘ 公司），Ｏｌｙｍｐｕｓ 光学显微镜。
       1.4  体外抑菌实验采用试管对倍稀释法测定五倍子醇提液对铜绿假单胞菌的ＭＩＣ 同时，平行测定其对Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ２７８５３ 的ＭＩＣ，作质量控制。测定技术依据ＮＣＣＬＳ ２００４ 标准［４］ 。五倍子醇提液对铜绿假单胞菌的ＭＩＣ 为３１．２５ ｍｇ／ｍｌ 。
       1.5  体外ＢＦ 模型的制备按文献方法［５］ 并进行改良，将复苏后传代培养１６ ｈ 的铜绿假单胞菌接种于ＬＢ 平板中传代二次，挑取典型菌落接种至ＬＢ 肉汤３７℃培养２４ ｈ，用ＰＢＳ 调整细菌浓度为０．５ 麦氏浊度（含菌量约１０８ ＣＦＵ／ｍｌ）。将高分子滤膜制成直径为７ ｍｍ 圆片，经压力蒸气灭菌后平铺在ＬＢ 平板表面；取２０ μｌ 铜绿假单胞菌菌液滴加在膜片表面，３７℃培养２４ ｈ 制成生物膜片，再将膜片转移至新的培养基中，连续转移５ 次培养７ ｄ，即可形成成熟的ＢＦ。
       1.6  五倍子醇提液对铜绿假单胞菌ＢＦ 的影响根据受试菌株的ＭＩＣ 值（３１．２５ ｍｇ／ｍｌ）以及细菌ＢＦ 对抗菌药物的耐受性大于浮游菌的原理［６］ ，用无菌生理盐水将五倍子醇提液分别调整为对受试菌的２ 倍ＭＩＣ（６２．５０ ｍｇ／ｍｌ），１．５ 倍ＭＩＣ （４６．８８ ｍｇ／ｍｌ），１ 倍ＭＩＣ （３１．２５ ｍｇ／ｍｌ），１／２ＭＩＣ （１５．６３ ｍｇ／ｍｌ）系列浓度各２ ｍｌ，并设置不含药物的空白对照，置２５℃水浴预温５ ｍｉｎ。取连续培养７ ｄ 的细菌生物膜的载体，用ＰＢＳ 冲洗未附着细菌，再将其浸入受试药液各浓度试管中，分别于０，４，８，２４ ｈ 将试管置旋涡混合器上以２ ２００ ｒ／ｍｉｎ 震荡混合１０ ｍｉｎ，使载体表面的ＢＦ及ＢＦ 内的细菌脱落到试管内形成菌悬液，再用连续稀释法进行活菌计数，每次测定均重复３ 次计算平均值，每个时间段计数３份标本，结果用±s 表示。
       1.7  统计学处理所有实验数据均用ＳＡＳ 统计分析系统进行处理，数据处理运用t检验、方差分析进行统计。
       2  结果
       2.1  五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌的ＭＩＣ 测定结果五倍子醇提液对铜绿假单胞菌的ＭＩＣ 为３１．２５ ｍｇ／ｍｌ 。见表１。
       表1  五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌的MIC测定结果（略）
       2.2  五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌生物膜存活细菌数的影响见表２。当用五倍子醇提液１５．６３ ｍｇ／ｍｌ（１／２ ＭＩＣ），３１．２５（１ＭＩＣ） ｍｇ／ｍｌ 浓度作用生物膜细菌，在４，８，２４ ｈ 时ＢＦ 的活菌数与生理盐水对照组比较，无显著性差异（P＞０．０５）。当继续增加药物浓度至４６．８８ ｍｇ／ｍｌ（１．５ ＭＩＣ）时，在４，８，２４ ｈ 时ＢＦ 的活菌数明显减少，与生理盐水对照组比较，有显著性差异（P＜０．０５），但２４ ｈ 内ＢＦ 中的细菌不能被完全清除。各时间段之间活菌数差异没有显著性（P＞０．０５）。当再继续增加药物浓度至６２．５０ ｍｇ／ｍｌ（２ ＭＩＣ）时，在４，８，２４ ｈ 时ＢＦ 的活菌数无，与生理盐水对照组比较，有极显著性差异（P＜０．０１） ，２４ ｈ 内ＢＦ 中的细菌被完全清除。结果表明４６．８８ ｍｇ／ｍｌ 的五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌ＢＦ 有清除效应，但不能被完全清除ＢＦ 细菌；而６２．５０ｍｇ／ｍｌ 的五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌ＢＦ 有完全清除效应。
       表2  培养7 d的生物膜载体经五倍子醇提液不同药物浓度作用后的活菌计数（略）
       与对照组比较，*P＜0.05
       3  讨论
          
       本研究结果显示，虽然五倍子醇提液对黏液型铜绿假单胞菌浮游菌的ＭＩＣ 值为３１．２５ ｍｇ／ｍｌ （见表１），但１ 倍或１．５ 倍ＭＩＣ的五倍子醇提液不能完全清除生物膜细菌（见表２），其研究结果说明生物膜内细菌比浮游菌的抗药性增加，可能与五倍子有效抑菌成分难于透过以藻酸盐为主要成分的铜绿假单胞菌生物膜有关。
       
       本次研究结果还显示，将培养７ ｄ 的ＢＦ 载体，经五倍子醇提液１５．６３，３１．２５ ｍｇ／ｍｌ 药物浓度作用后的活菌计数显示：该药物剂量对ＢＦ 基本无效（表２），与文献［６］ 报道相符。当五倍子醇提液浓度增加至４６．８８，６２．５０ ｍｇ／ｍｌ 作用４，８，２４ ｈ 时，经活菌计数显示，3个时间段均出现活菌数明显减少和无的趋势（表２），与对照组比较，有显著性差异（P＜０．０５）和极显著性差异（P＜０．０１）。结果表明对五倍子醇提液对铜绿假单胞菌生物膜细菌有清除效应和完全清除效应。
       
       中草药抗菌作用一直不被重视，原因是抗菌效果远不及抗生素，而本次实验结果显示五倍子醇提液对黏液型铜绿假单胞菌ＢＦ 有较好的清除效应，其抗菌的有效成分有待于进一步研究。本次实验选择中草药五倍子，目的在于用五倍子治疗慢性细菌性感染能有效缓解抗生素用药的选择性压力，为临床治疗提供中草药抗ＢＦ 的实验依据。本次试验环境与人体内环境有一定差异，研究结果还有待于进行临床用药试验，以确定疗效。
       【参考文献】
         　　［1］ 李仲兴，王秀华，张明明，等．五倍子乙醇提取物对金葡菌的体外抗菌研究［Ｊ］．中药新药与临床药理，２００５，１６（２）：１０３．
       
       ［2］ Ｔｕｎｎｅｙ ＭＭ， Ｒａｍａｇｅ Ｇ， Ｆｉｅｌｄ ＴＲ， Ｍｏｒｉａｒｔｙ ＴＦ， Ｓｔｏｒｅｙ ＤＧ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ［ Ｊ ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， ２００４， ４８（５）：１８７９．
       
       ［3］ 宋小妹， 唐志书．中药化学成分提取分离与制备［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，２００４，３．
       
       ［4］ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ［Ｓ］．ＮＣＣＬＳ，２００４．１．
       
       ［5］ Ａｎｄｅｒｌ ＪＮ，Ｚａｈｌｌｅｒ Ｊ，Ｒｏｅ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ －ｐｈａｓｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｉｎ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｂｉｏｆｉｌｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ ［Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００３，４７（４）：１２５１．
       
       ［6］ Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ Ｗ， Ｖｅｅｈ Ｒ，Ｓｈｉｒｔｌｉｆｆ Ｍ ， ｅｔ ａｌ ．Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｆｉｌｍ ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ［Ｊ］．Ｊ ＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，２００３，１１２（６０）：１４６３．