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       【摘要】 
       目的优化味连简单序列重复间扩增多太性(Coptis chinensis Ｆｒａｎｃｈ．ＩＳＳＲ)反应体系。方法利用正交实验设计，从Ｍｇ２ ＋，ｄＮＴＰ，引物，ＢＳＡ 这４ 种因素３ 个水平进行优化。结果确立了适合黄连ＩＳＳＲ 分析的反应体系，即在２５ μｌ 反应体系中，内含１ ×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２ ＋，２００ μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，０．４ μｍｏｌ／Ｌ 引物，４０ ｎｇ 模板，１Ｕ Taq ＤＮＡ 聚合酶，ＢＳＡ １ μｇ／μｌ。结论利用此优化反应体系能得到清晰、稳定的图谱。
       【关键词】  黄连 简单序列重复间扩增多太性 正交设计 反应体系
       Optimization for ISSR Reaction System in Coptis chinensis Franch．Using Orthogonal Design
       ＣＨＥＮ Ｄａｘｉａ， ＬＩ Ｌｏｎｇｙｕｎ， ＱＵ Ｘｉａｎｙｏｕ， ＰＥＮＧ Ｒｕｉ
       （Chongqing Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing ４０００６５， China）
       Abstract:ObjectiveＴｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ＩＳＳＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ Coptis chinensis Ｆｒａｎｃｈ．MethodsＯｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅsｔｉｇａｔｅ ｆｏｕｒ ｆａｃｔｏｒｓ（Ｍｇ２ ＋，ｄＮＴＰ，ｐｒｉｍｅｒ，ＢＳＡ） ａｔ ｔｈｒｅｅ ｌｅｖｅｌｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ResultsＡ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ Coptischinensis Ｆｒａｎｃｈ．ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ，ｔｈａｔ ｗａｓ， ２５ μｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １ ×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２ ＋，２００ μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，０．４ μｍｏｌ／Ｌ ｐｒｉｍｅｒ，４０ ｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ，１Ｕ Taq  ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＢＳＡ １ μｇ／μｌ．ConclusionＡ ｒｅｌiａｂｌｅ ｇｒａｐｈ ｃａｎ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ．
       Key words:Coptis chinensis Ｆｒａｎｃｈ．；  ＩＳＳＲ；  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ；  Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ
       
       简单序列重复间扩增多态性（ｉｎｔｅｒ －ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ，ＩＳＳＲ）是Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ 等［１］ 于１９９４ 年建立的新型分子标记技术。该技术针对真核生物基因组中普遍存在的简单重复序列（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）本身设计引物，并在ＳＳＲ 的３’或５’端加锚１ ～４ 个随机碱基，对两侧具有反向排列的ＳＳＲ 间的基因组片段进行扩增。具有操作简单、成本低廉、多态性高等优点，近年来，在植物遗传研究中得到了广泛的应用［２ ～４］ 。但ＩＳＳＲ 是基于ＰＣＲ 的一种标记，易受许多因素的干扰，其最佳扩增条件在不同物种各有不同，因此为了获得重现性、可靠性均较高的图谱，完全有必要对各因子的最佳反应条件进行探索，建立稳定的反应体系。在各种优化实验中，大多研究者采用单因素实验，不仅费时，而且容易忽视每个因素同时变化对反应的影响，正交实验设计却能在一次实验中了解各因素之间的内在规律，较快地找到最优的水平组合。本研究以味连Coptis chinensis Ｆｒａｎｃｈ．基因组ＤＮＡ 为模板，采用正交试验设计对其ＩＳＳＲ 反应体系进行优化，为下一步黄连种质资源遗传多样性研究提供技术支撑。
       1  器材与方法
       １．1  供试材料黄连Coptis chinensis Ｆｒａｎｃｈ．采自四川、重庆、陕西、湖北等主产地，由本院生药栽培室研究员李隆云鉴定。在成熟植株上选取当年萌发的幼嫩叶片，低温条件下带回实验室洗净、晾干，冷冻于－８０℃超低温冰箱中备用。
       １．2  仪器Ｓｍａｒｔ ＳｐｅｃＴＭ３０００ 型分光光度计（ＢＩＯ －ＲＡＤ 公司）、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．ＴＰ６００ 扩增仪（宝生物工程有限公司）、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ２０００ 凝胶成像系统（ＢＩＯ －ＲＡＤ 公司）、ＤＹＣＰ －３４Ａ 型琼脂糖水平电泳槽（北京市六一仪器厂）、ＤＹＹ －６Ｃ 型电泳仪（北京市六一仪器厂）。
       １．3  试剂Taq 酶（Ｐｒｏｍｅｇａ），ｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ），λ－ＥｃｏＴ１４Ｉ ｄｉｇｅｓｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ （ＴａＫａＲａ）、ＣＴＡＢ （Ａｍｒｅｓｃｏ）、ＰＶＰ （Ｓｉｇｍａ）、β－疏基乙醇（Ｓｉｇｍａ）、琼脂糖（进口分装）、ＩＳＳＲ 引物（北京赛百盛基因技术有限公司合成）。其余均为国产分析纯试剂。
       １．４  黄连基因组ＤＮＡ 的提取取１ ｇ 黄连幼嫩叶片采用ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ。采用琼脂糖凝胶电泳法检测提取的ＤＮＡ是否降解，同时测定其浓度和纯度，并将样品稀释为４０ ｎｇ／μｌ，用于ＩＳＳＲ 反应条件的优化实验。
       １．５  正交实验设计本试验采用Ｌ９ （３４ ）正交法，对影响ＩＳＳＲ －ＰＣＲ 扩增的主要因素： Ｍｇ２ ＋、ｄＮＴＰ、引物、ＢＳＡ 设计４ 因素３ 水平的正交实验，共９ 个处理。ＩＳＳＲ －ＰＣＲ 各反应成分的因素水平及正交实验见表１。
       表1  ISSR-PCR正交实验设计（略）
       １．６  ＰＣＲ 扩增与产物检测根据预实验的结果，以ＵＢＣ８５７ 为引物进行ＰＣＲ 正交实验。反应体系为２５ μｌ，内含１ ×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、４０ ｎｇ 模板、１Ｕ Taq ＤＮＡ 聚合酶，其余反应成分按表１ 加样。扩增程序为９４℃预变性５ ｍｉｎ，然后进行３５ 个循环：９４℃变性３０ｓ，５３．５℃复性１ ｍｉｎ，７２℃延伸１．５ ｍｉｎ，循环结束后７２℃延伸７ｍｉｎ， －４℃保存。
       
       扩增产物在１．５％（W／V）的琼脂糖凝胶上电泳分离，电压不超过５Ｖ／ｃｍ。电泳结束后，用０．５ μｇ／ｍｌ 的ＥＢ 染色１５ ～３０ ｍｉｎ，在凝胶成像系统上观察并照相记录。
       2  结果与分析
       ２．1  正交实验结果正交试验结果如图１ 所示。组合９ 仅扩增出一条极弱的条带。组合３ 扩增出分子量偏低的一些条带，而组合６ 扩增出的却是分子量偏高的条带。其余组合扩增的条带数基本一致，但条带的强度及背景有明显区别：组合１ 的背景清晰，但条带较少、较弱；组合５，７，８ 扩增出的条带强，但条带之间的界限不分明，模糊难以辨认，且非特异性扩增增强导致背景不清晰；从总体上看，组合２，４ 的扩增效果最为理想，两者相比较而言，组合４ 的非特异性扩增产物增多，背景没有组合２ 的清晰。综合以上分析，本研究确定组合２ 为最佳，即在２５ μｌ 体系中：Ｍｇ２ ＋１．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ ２００ μｍｏｌ／Ｌ，引物１ μｍｏｌ／Ｌ，ＢＳＡ １ μｇ／μｌ。
       1～9:处理代号
       图1  ISSR-PCR正交实验设计结果（略）
       ２．２  优化反应体系的扩增效果通过上述正交实验建立了适合黄连ＩＳＳＲ分析的反应体系，即在２５ μｌ 反应体系中，内含１ ×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２ ＋，２００ μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，０．４ μｍｏｌ／Ｌ 引物，４０ ｎｇ 模板，１Ｕ ＴａｑＤＮＡ 聚合酶，ＢＳＡ １ μｇ／μｌ。
       
       用上述反应体系进行黄连种质资源遗传多样性研究，能得到清晰、稳定的图谱，图２ 所示为引物ＵＢＣ８５７ 的扩增结果。
       1～16：样品代号
       图2  优化的反应体系的扩增效果（略）
       3  讨论
          
       影响ＩＳＳＲ －ＰＣＲ 反应的因素相当复杂，且各因素之间存在互作效应，如Ｍｇ２ ＋不仅能影响Taq 酶的活性，还能影响引物与模板的结合效率、产物的特异性、模板与产物的解链温度以及引物二聚体的形成；ｄＮＴＰ 分子中的磷酸基团能定量地与Ｍｇ２ ＋结合，使游离的Ｍｇ２ ＋浓度降低。因此，各因子之间的浓度配比只有达到最佳状态时，才能得到稳定的、可重复的扩增结果。
       
       目前，ＩＳＳＲ 反应体系的优化方法多种多样，用得较多的是采用单因素或双因素设计的方法［５，６］，通过多次实验找到扩增稳定的最佳反应体系。近年来，正交设计开始用于各种ＰＣＲ 反应体系的优化中［７ ～９］。该方法是根据统计学原理［１０］，从复因子实验的结果中，挑选几个处理进行部分实验，了解全面实验的情况和因素之间的内在规律，较快的找到最优的水平组合。与单、双因素设计比较而言，正交设计减少了许多的处理组合，通过一次实验就得到了最佳反应体系，不仅大大地节约了时间，且能降低实验费用，这表明正交实验是优化ＩＳＳＲ －ＰＣＲ 反应体系的较为理想的方法。
       
       本分子生物学实验在西南大学蚕桑学重点实验室完成，特致谢忱！
       【参考文献】
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