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       【摘要】 
       目的建立利用原子吸收鉴别中药材贝母的方法。方法利用原子吸收分光光度器和定碳定硫器对10种产地贝母中的16种微量元素进行了测定。结果测定出贝母中16种微量元素的含量，并以测定结果含量为指标，提取特征因子，再利用特征因子作分析。结论此方法可以用于中药材贝母的鉴别和分析。
       【关键词】  贝母 微量元素 聚类分析 鉴别
       The Measurement and Analysis of Sixteen Elements in Ten Sorts of Fritillaria of Traditional Chinese Medicine
       ZHANG Liang, LI Li, YUAN Yu, LI Yufeng*
       (College of Biological Engineering, Xihua University, Sichuan Chengdu 610039, China; Hong-Bo Co.Ltd, Sichuan Chengdu 610000, China)
       Abstract:ObjectiveTo establish an identification method for Fritillaria by atomic absorption. MethodsThe atomic absorption spectrophotometry and sulfur&carbon detector were used to determine 16 trace elements in 10 species of Fritillaria origin of determination.ResultsThe contents of 16 trace elements were determined and feature factors were extracted and analyzed.ConclusionThis method can be used for medicines Fritillaria identification and analysis.
       Key words:Fritillaria;  Trace elements;  Cluster analysis;  Identification
       
       微量元素在生物体中含量不足万分之一，但对人体的健康起着重要作用。它们在维持某些维生素的活性，参与激素的生理作用，协助体内某些物质的运输以及维持核酸的正常代谢等生命活动起着重要作用［1］。中药材中所含微量元素也日益受到重视，微量元素的测定可为阐明中药物质基础、鉴定与改良药材品种提供基础数据［2］。
       
       贝母为目前常用中药，具有清热润肺、化痰止咳等功效，主治肺热燥咳，干咳少痰，咳痰带血等症［3］。为了全面评价贝母质量，构建道地性川贝母质量标准，并为品种鉴别提供依据，有必要对其微量元素的含量作系统的测定。本研究选取市售10种不同产地、品种贝母，并对其16种微量元素含量进行测定与分析。有报道表明［4］市场上有不法商人利用硫磺熏的方法使贝母颜色发生变化，以次充好。本研究使用碳硫检测仪对这10种贝母中硫和碳含量进行了测定，为辨别良品贝母和劣品贝母提供一种方法。
       1  器材
       1.1  药材药材见表1，均购自四川成都荷花池药材批发市场，并由四川成都西华大学制药工程系鉴定，均为正品，符合2005版《中国药典》规定。
       1.2  仪器Perkin Elmer AAnalyst700原子吸收分光光度器；Perkin Elmer AS800自动进样器；Dell电脑；LECO CS600碳硫检测仪；Sartorious分析天平；马弗炉；电炉；纯水仪等。
       1.3  试剂14种元素标准品（购自国家标准物质研究中心）；硝酸（优级纯）；高氯酸（分析纯）；硫酸（分析纯）；双氧水（优级纯）；硝酸镧(分析纯)；氯化铯(色谱纯)；助溶剂纯铁粉（太原钢铁集团有限公司钢铁研究所），钨锡助熔剂（LECO公司生产，Part No:501～008）。
       2  方法
       2.1  样品处理参照吴刚等［5］的方法并略作改进。取适量样品，用液氮处理后用碾钵碾至粉末，然后过100目筛，并在50℃干燥箱中烘烤3 h，在精密称取各种贝母样品约1 g，加入硝酸和高氯酸混合液，在调温电炉上加热至黄烟消尽，样品完全溶解，溶液呈清亮状态（约0.5 h），若有需要可经干燥滤纸过滤。再转移至100 ml容量瓶中，用纯水定容。
       2.2  测定方法及条件按照原子吸收分光光度仪标准操作规程操作。火焰原子吸收测定时采用空气-乙炔火焰，其中测定钙含量时采用乙炔-氧化亚氮火焰。每个样品系统自动检测3次，并取平均值和算出RSD值均小于2%。测定条件见表2～3。石墨炉原子吸收法测定条件见表3。对于贝母中的非金属元素硫和碳，本研究采用碳硫检测仪，方法如下：精确称量约0.05 g样品于专用坩埚中，并加入0.5 g纯铁粉和1 g钨锡助熔剂。按照碳硫检测仪标准操作规程操作，每个样品做3次，取平均值。测定条件如下：最短时限40 s,比较器水平8%，有效位数2位，积分延迟0 s。以氧气作为载气，进气压力35 psi，上端进气压力12 psi,下端进气压力12   psi,背压755.4 mmHg，氧气流量3 L/min,环境温度25℃。
       表1  实验用药材及产地（略）
       表2  空气-乙炔火焰原子吸收法仪器操作条件（略）
       表3  氧化亚氮-乙炔火焰原子吸收法仪器操作条件（略）
       表4  石墨炉原子吸收法仪器操作条件（略）
       3  结果与讨论
       3.1  样品处理条件的优化
       3.1.1  干法处理和湿法处理的选择为了使样品充分硝化，本实验研究了干法灰化和湿法硝化对样品结果的影响。在湿法硝化的过程中采用HNO3-HClO4，HNO3-HCl，HNO3-H2SO4和HNO3-H2O2作为混酸液测定结果；在干法处理中，先通过电炉炭化样品，再通过马弗炉灰化样品，最后加入混合酸溶液，并定容，也测定结果。发现在干法处理中一些元素对高温比较敏感，造成测定含量偏低，同时该法由于处理过程相对复杂，耗时较多，也通过查阅一些资料［6］，最后发现采用湿法处理结果最为理想。
       3.1.2  硝化液种类的选择为了使测定结果更加准确，消除在湿法处理时由于混酸种类的选取造成对结果的影响。本研究选取了,HNO3-HCl，HNO3-H2SO4，HNO3-H2O2，HNO3-HClO4 4种混合酸硝化体系作比较，溶液配比均为2∶1。以Cu,Co,Cr含量测定为例，研究混酸体系对测定结果的影响。结果见表5。
       表5  不同混合酸体系对测定结果的影响（略）
       3.1.3  硝化液体积比的影响对混酸液中两种酸液的配比作1∶1，3∶1，5∶1，7∶1单因素实验。结果见表6。由表6知，选取硝酸和高氯酸3∶1配置效果最好。
       表6  硝化液配比对测定结果的影响（略）
       3.1.4  测定过程中干扰的控制在测定K,Na元素时为排除离子化干扰，在样品、空白和标准溶液中加入了5 ml 10%CsCl溶液作为消电离剂。因为在测定这些元素时，它们容易在溶液中水解，造成在火焰原子化时，基态原子数目下降。在加入CsCl溶液后，其在溶液中大量水解，在火焰原子化时消耗大量能量，阻止K，Na基态原子电离，从而增加检测精度。
       
       在测定Ca元素时，为了排除由于磷酸盐存在可能出现的化学干扰，在样品、空白和标准溶液中加入了La(NO3)3硝酸镧作为释放剂，因为磷酸盐和钙离子反应所产生的磷酸钙在火焰时极难原子化，造成测定结果偏低。在加入后，镧和磷酸生成更稳定的化合物，从而将钙释放出来，使测定结果更加准确。
       3.2  测定结果样品处理后，K，Na，Fe，Cu，Co，Cr，Mn，Ca，Mg，Pb，Zn元素采用火焰原子吸收光谱法测定，Ni、Si、Al元素采用石墨炉原子吸收光谱法测定。结果见表7。对于贝母中的非金属元素S、C，本研究采用碳硫检测仪。测定结果见表8。
       表7  10种不同产地、品种贝母的12种元素测定结果（略）
       表8  10种贝母硫和碳含量测定结果（略）
       3.3  因子分析与聚类分析聚类分析是将一批物体或变量按照它们在性质上亲疏远近的程度进行分类，采用谱系聚类方法可以将一个样品集化分为若干聚类。在这方法中，聚类的排列方式是小类包含在大类中，其分析的典型结果是一个谱系图［7］。用标准化特征数据计算各样品间欧氏距离平方，此距离综合反映了两个样品之间的每个指标之间的大小。
       
       在本研究中先利用SSPS14.0软件，对10种贝母的16种微量元素进行因子分析，即是对这10种贝母的每一种元素的含量进行差异性分析。软件分析表明以Pb，Zn，Ni，Co，Cr，Si为关键因子分析，最能体现出不同产地和品种贝母之间的差异性。
       
       对提取出的这6种关键因子作聚类分析，在统计量上采用群度凝集过程和近似性矩阵，图形上采用垂直方向的树状图，方法上采用以欧基里德直线距离平方为依据构建群间联接。因为采用欧基里德直线距离平方能够消除在聚类过程中由于差减产生的负值对结果的影响。结果见图1。
       图1  10种贝母6种关键因子聚类分析图（略）
       4  讨论
          
       表7测定结果表明，这10种贝母中钾、钠、镁、钙、铁等矿物元素的含量很丰富，均接近或超过100 μg·g-1。 新疆产伊贝母的Na和Ca含量偏高，平均值为361.25 μg·g-1和457 μg·g-1，而除小金产贝母外，其它产地贝母的Na和Ca含量均偏低，平均值为123.6 μg·g-1和191.2 μg·g-1。其它微量元素的含量分析表明，四川产地的贝母样品与省外产地样品也呈现出一定的差异。但同种或相同地域的贝母在微量元素含量上差异较小。测定结果能够在一定程度上反映出药材本质，该方法也可作为鉴别贝母药材的一种手段。
       
       表8表明，10种样品的碳含量差别不大，而硫含量却差别较大，这可能和药材产地的土壤条件有较大关系。硫是土壤中一种比较主要的元素，一般来说土壤开垦时间越长，土壤中所含的硫会越低，土层越向下，硫含量也会越低。有报道表明［8］，土壤如果硫含量过低，会使其所产出的作物有致癌的可能。以上样品的测定结果能反映对应产地的土壤情况。同时，对于市场上出现的用硫磺熏蒸的方法对贝母外表处理的现象，也可以用表8的数据来判别是否是用劣质贝母以次充好。
       
       对6个特征因子的聚类分析（图1）表明，5号松蕃产贝母和9号拉萨产贝母亲缘关系最近，而3号新疆温泉产贝母和7号新疆塔城产贝母遗传距离最近，这就说明贝母中微量元素的含量和其产地具有相关性，产地地理环境和距离越相近其亲缘关系越近。分析表明，其它贝母与浙贝母的差异均较大，而浙贝母不论是其形状特征还是临床药理作用都与其他贝母都有较大差别［9］。因此，图1的聚类分析，可以从微量元素的角度阐明，揭示出植物分类系统与化学成分间存在着联系性这一概念，但因地理位置的不同，土壤气候条件不同，使样品体内代谢过程也发生了一定的改变，其所含的活性成分也有差异，也能够反映出不同谱系贝母之间的差异。
       
       在学术界对用中药材微量元素含量来分析和鉴别药材还存在一些争议，但笔者认为用中药材微量元素含量来分析和鉴别药材的方法，从原理上讲是可行的。因为中药材的鉴别应联系其临床药理药效，而任何中药的疗效必然和复杂的化学组分相联系，可能并不是单一组分发挥作用，很可能是多组分协同发挥，而微量元素是其重要化学成分之一。分析和鉴别药材差异的一个重要因素是地域差异，而药用植物微量元素含量的变化正是体现了这种地域差异，两者是有必然联系的。
       【参考文献】
         　　［1］ 曹治权．微量元素与中医药［M］.北京：中国中医药出版社，1990.
       
       ［2］ 敖书华．中药微量元素的研究概况［J］.中国中药杂志，1992，27(8)：457.
       
       ［3］ 中国药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：25．
       
       ［4］ 陈长利，牛晓勤．漫谈口服液制剂［J］.中国药学杂志，1998，12(2)：45.
       
       ［5］ 吴 刚，张丽萍，赵树忠，等．蒙药配方中常用药材的微量元素分析［J］.广东微量元素科学，2003，10 (2)：36.
       
       ［6］ 李 峰，王 黎，刘彦明，等.火焰原子吸收光谱法测定中成药中微量元素［J］.信阳师范学院学报(自然科学版)，2006，10(4)：463.
       
       ［7］ 乌莉娅·沙依提，张 帆.常用伞形科类维药中微量元素含量与聚类分析［J］.亚太传统医药，2006，12：65.
       
       ［8］ 方清茂，李 昆．川黄连的土壤与药材中部分微量元素的含量［J］.华西药学杂志，2002，17(4)：282.
       
       ［9］ 李玉峰，李栓美，陈 放. 中药材贝母的微量元素含量测定和分析［J］.广东微量元素科学,2005,12(10):57.