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       【摘要】 
       目的观察中药复方“通脉口服液”对体外培养条件下大鼠肾小球系膜细胞（ＭｓＣ）增殖和分泌ＩＬ －１β的影响。方法应用细胞培养技术进行肾小球系膜细胞的传代培养，采用血清药理学方法，制备通脉口服液含药血清、黄芪含药血清、三七含药血清，采用ＭＴＴ 法观察各组含药血清对正常培养条件下及ＬＰＳ 刺激状态下肾小球系膜细胞增殖的影响，ＥＬＩＳＡ 法测定ＬＰＳ 刺激下通脉口服液组细胞上清中ＩＬ －１β的含量。结果3组含药血清均可抑制大鼠肾小球系膜细胞的增殖，三组之间比较，通脉口服液组作用要优于黄芪组及三七组。ＥＬＩＳＡ 结果表明：通脉口服液含药血清可以抑制肾小球系膜细胞分泌ＩＬ －１β。结论中药复方“通脉口服液”可抑制肾小球系膜细胞的增殖及ＬＰＳ 诱导的系膜细胞ＩＬ －１β的产生，肾小球系膜细胞是通脉口服液防治慢性肾炎，延缓肾小球硬化的重要靶细胞之一。
       【关键词】  通脉口服液 慢性肾小球肾炎 细胞培养 白细胞介素－１β
       Effects of Tongmai Oral Solution on Cell Proliferation and Interleukin －１β Production in Mesangial Cells
       ＺＨＯＮＧ Ｄａｎ ，ＹＡＮＧ Ｎｉｚｈｉ ， ＺＨＡＯ Ｄａｉｘｉｎ ， ＬＩＵ Ｍｉｎｇｐｉｎｇ
       （Jinggangshan Medical College，Ji＇an， Jiangxi ３４３００0，China； Second Affiliated Hospital，Guangzhou University of TCM，Guangzhou ５１０１２０，China； College of Pharmacology，Guangzhou University of TCM，Guangzhou ５１０４０５，China）
       Abstract:ObjectiveＴｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｏｎｇｍａｉ Ｏｒａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ －１β（ＩＬ －１β） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌｓ（ＧＭＣ）．MethodsＧＭＣ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ vitro ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｔｏｎｇｍａｉ Ｏｒａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＭ），Ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｈｕａｎｇｑｉ ａｎｄ Ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｓａｎｑｉ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｒｕｍ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉ ｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ （ＭＴＴ） ａｓｓａｙ ａｎｄ ＩＬ －１β ｌｅｖｅｌ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ －ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ） ｗｅｒｅ uｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＴＭ －ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ，Ｈｕａｎｇｑｉ －ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｓａｎｑｉ －ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｒｕｍ．ResultsＴＭ －ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｒｕｍ，Ｈｕａｎｇｑｉ －ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｓａｎｑｉ －ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉbｉｔ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＴＭ －ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＩＬ －１β ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＬＰＳ ａｎｄ ｔｈｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｂｙ ＴＭ －ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｒｕｍ．ConclusionＴｈｅ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ Ｔｏｎｇｍａｉ Ｏｒａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｒｉｎｇｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎiｓｍｓ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ，ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ＩＬ －１β ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｌockｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｒｅｇｉｏｎ．
       Key words:Ｔｏｎｇｍａｉ Ｏｒａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；  Ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｉｔｉｓ；  Ｍｅｓａｎｇｉａｌ Ｃｅｌｌ；  ＩＬ －１β
       
       系膜细胞过度增殖是导致肾小球硬化的重要原因，且其分泌的白介素－１β（ＩＬ －１β）在这一病理过程中起了关键作用［１］ 。因此积极寻找抑制系膜细胞过度增殖和调控ＩＬ －１β产生与表达的药物对防治肾小球硬化具有重要意义。通脉口服液是广东省中医院肾内科杨霓芝教授在多年临床和实验研究的基础上，制订的防治慢性肾炎的基本方药。其主要药物包括黄芪、三七等，数药合用，起到益气活血的作用，直接针对慢性肾炎基本发病机理而设。既往研究已表明通脉口服液可以有效地改善慢性肾炎患者的临床症状及肾功能［２］ ，减轻慢性肾炎模型动物的肾脏病理损害［３］ 。在本研究中，我们观察了通脉口服液对肾小球系膜细胞增殖及分泌ＩＬ －１β的影响，希望能在更深层次上探讨其防治肾小球硬化的作用机理。
       1  器材与方法
       １．1  药物中药复方通脉口服液：１０ ｍｌ／支，由广东省中医院提供，批号２００４１０２６４；黄芪、三七水煎液：由广州中医药大学中药学院实验中心提供。
       １．２  动物ＳＤ 雄性大鼠２０ 只，ＳＰＦ 级，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：０００３４６７，许可证号：ＳＣ ×Ｋ（粤）２００３－０００１。
       １．３  细胞大鼠肾小球系膜细胞购至武汉大学典藏细胞库（编号：ＨＢＺＹ －１）。
       １．４  仪器及试剂超净工作台（苏州净化设备厂）；倒置显微镜（日本Ｎｉｋｏｎ 公司）；ＣＯ２ 恒温培养箱（美国Ｈａｒｒｉｓ 公司）；酶联免疫检测仪（ＢＩＯＲＡＤ Ｓｍａｒｔｓｐｅｃ３０００ 型）；相差显微镜（日本Ｎｉｋｏｎ公司）；超低温冰箱（美国Ｈａｒｒｉｓ 公司）；四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）、脂多糖（ＬＰＳ）均为Ｓｉｇｍａ 公司产品； ＩＬ －１βＥｌｉｓａ 试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。
       １．5  方法
       １．５．１  肾小球系膜细胞（ＭＣ）培养肾小球系膜细胞（ＭＣ）购回立即吸掉５０％培养液，加入１０％ＦＣＳ 的ＤＭＥＭ 培养液，第２ 天开始取细胞株进行传代培养：吸掉培养液，加约２ ｍｌ 胰酶消化液（内含０．２５％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ），轻摇培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。轻轻吹打细胞，吸出消化液和细胞，加入１５ｍｌ 离心管内，离心（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１０ ｍｉｎ），吸出上清液，加入培养液，再次离心（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１０ ｍｉｎ），吸出上清液，加入含１０％ＦＣＳ的培养液。分装２ 个２５ ｃｍ２ 培养瓶，放入ＣＯ２ 恒温培养箱（３７℃，５％ＣＯ２ ，饱和湿度）培养。２ ～３ ｄ 换１ 次液。每３ 天进行传代，共传３ ～４ 代。取第４ 代肾小球系膜细胞进行下游操作。
       １．５．2  药物及空白血清制备参照文献［４，５］ 方法制备药物血清，将ＳＤ 大鼠随机分为４ 组，即中药复方通脉口服液组、空白血清组、黄芪水煎液组、三七水煎液组，每组５ 只。各药物组均按临床成人用量的２０ 倍即８ ｇ（生药）／ｋｇ，灌胃给药，连续７ ｄ，第７ 天重复给药２ 次，间隔时间２ ｈ，并于末次给药后１ ｈ，无菌操作，眼眶静脉取血，静置１ ｈ，待血凝固后离心（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１０ ｍｉｎ），分离血清，并将含药血清置于５６℃水浴箱中，水浴３０ ｍｉｎ 灭活处理。置于－７０℃冰箱保存备用。空白血清组大鼠不作任何处理，在药物血清组采用的同时采血，分离血清，方法同上。
       １．５．３  分组及细胞活力实验实验分为空白对照组（加体积分数为１０％的正常大鼠血清）、通脉口服液组（加体积分数为１０％的含药血清）、黄芪组（加体积分数为１０％的含药血清）、三七组（加体积分数为１０％的含药血清）、ＬＰＳ 组（加体积分数为１０％的正常大鼠血清和终浓度为１０ μｇ／Ｌ 的ＬＰＳ）、ＬＰＳ 通脉口服液组（加体积分数为１０％的含药血清和终浓度为１０ μｇ／Ｌ 的ＬＰＳ）、ＬＰＳ 黄芪组（加体积分数为１０％的含药血清和终浓度为１０ μｇ／Ｌ的ＬＰＳ）、ＬＰＳ 三七组（加体积分数为１０％的含药血清和终浓度为１０ μｇ／Ｌ 的ＬＰＳ），共８ 组。细胞活力试验采用Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ 染色、细胞计数方法［６］，结果表明各组含药血清处理４８ ｈ 后，细胞存活率均达９６％以上，适合进行下游操作。
       １．５．４  细胞增殖检测采用四唑盐（ＭＴＴ）比色法，取细胞悬液于相差显微镜下计数，用含１０％ＦＣＳ 的ＤＭＥＭ 培养液调整细胞浓度到７ ×１０４ ／ｍｌ，转种于９６ 孔培养板中，１００ μｌ／孔，则每孔细胞数为７ ×１０３ ／ｍｌ。３７℃，５％ＣＯ２ ，饱和湿度条件下培养２４ ｈ，各孔均换液，加入不含ＦＣＳ 的ＤＭＥＭ 培养液２００ μｌ 以同步各组细胞于Ｇ０ 期。同步２４ ｈ 后，分为正常血清组及ＬＰＳ 刺激组：正常血清组加入１０％ＦＣＳ，原条件下继续培养；ＬＰＳ 刺激组在各孔中加入２００ μｇ／ｍｌ 浓度的ＬＰＳ（每孔总液体量为２００ μｌ，则ＬＰＳ 终浓度１０ μｇ／ｍｌ），每组设６ 个复孔。于培养１２，２４，４８，７２ ｈ 时分别取出相应的培养板，每孔加入ＭＴＴ ２０ μｌ（５ ｍｇ／ｍｌ），继续培养４ ｈ，小心吸弃各孔培养液，加入１００ μｌ ＤＭＳＯ，室温避光，轻轻振荡１０ｍｉｎ，使结晶充分溶解。选择４９０ ｎｍ 波长［6］，在酶标仪上读出OD值
       １．６  ＥＬＩＳＡ 法测定系膜细胞ＩＬ －１β蛋白分泌用含１０％ＦＣＳ的ＤＭＥＭ 调整细胞浓度到５ ×１０４ ～５ ×１０５ ／ｍｌ，转种于６ 孔培养板中，１ ｍｌ／孔，则每孔细胞数为５ ×１０４ ～５ ×１０５ ／ｍｌ。３７℃，５％ＣＯ２ ，饱和湿度条件下培养２４ ｈ，各孔均换液，加入不含ＦＣＳ 的ＤＭＥＭ 培养液１ ｍｌ 以同步各组细胞于Ｇ０ 期。然后分为:①空白对照组（加１０％ＦＢＳ）；②ＬＰＳ 组（ＬＰＳ１０ μｇ／ｍｌ）③ＬＰＳ ＋通脉口服液组（１０％通脉口服液含药血清＋１０ μｇ／ｍｌ ＬＰＳ），共３ 组，每组设复孔４ 个。５％ＣＯ２ ，饱和湿度条件下继续培养。于培养３，６，１２，２４ ｈ 时分别取出相应的培养板，收集各组上清液，采用ＥＬＩＳＡ 方法，酶标仪测定４９０ ｎｍ 吸光度，据标准曲线测定其中ＩＬ －１β的浓度。
       １．7  统计学处理各组数据用珋 ±s 表示，采用ＳＰＳＳ１３．０ 统计软件包对检测数据进行统计分析。组间比较采用方差分析，方差不齐者改用秩和检验的Ｋｒｕｓｋａｌ －Ｗａｌｌｉｓｈ 方法进行多个样本比较及两两比较。
       2  结果
       ２．1  各组含药血清对系膜细胞增殖的影响结果见表１。
       
       表１ 结果显示：中药复方通脉口服液组、黄芪组及三七组，对正常培养及ＬＰＳ 刺激条件下肾小球系膜细胞的增殖均有显著或非常显著性的抑制作用（与空白组相比较），而中药复方“通脉口服液”组与黄芪组、三七组相比抑制作用更为显著（P ＜０．０５）。黄芪组与三七组之间比较无显著性差异。
       表1  各组含药血清对MC增殖的影响（略）
       与空白血清组比较，**P<0.01；与通脉口服液组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与LPS通脉口服液组比较，▲▲P<0.01；n=6
       ２．２  通脉口服液对系膜细胞ＩＬ －１β蛋白分泌的影响结果见表２。结果显示,ＬＰＳ 组在不同时间段较空白对照组ＩＬ －１β产生量均明显增加，且有非常显著差异（P ＜０．０１），并在加入ＬＰＳ １２ｈ 时分泌量最多，但与其它时间点比较差异无显著性（P＞０．０５）。ＬＰＳ ＋通脉口服液组与ＬＰＳ 组在６，１２，２４ ｈ 比较ＩＬ －１β分泌量均下降，在６，１２ ｈ 两个时间点有非常显著性差异（P ＜０．０１），而２４ ｈ 时间点有显著性差异（P ＜０．０５）。在３ ｈ 时间点ＬＰＳ ＋通脉口服液组与ＬＰＳ 组比较ＩＬ －１β无明显差异。
       表2  各组分在不同时段对大鼠系膜细胞IL-1β水平（略）
       与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与LPS比较，△△P<0.01；n=4
       3  讨论
          
       自1975年Fish 等［7］ 首次在体外培养中获得较纯肾小球系膜细胞（ＭＣ）以来，肾小球系膜细胞的体外培养为研究各种肾小球疾病提供了基础条件，是研究增殖性肾小球肾炎必不可少的手段之一。肾小球系膜细胞增殖及系膜基质聚积，是多种肾小球疾病，尤其是系膜增生性肾炎突出的病理学特征。正常情况下，人体内肾小球系膜细胞的数量、形态和位置保持相对的稳定，而在体外培养条件下，用于实验研究的细胞均处于指数生长期，在此阶段，细胞若处于理想的培养条件，将不断的生长繁殖，细胞数量日渐增加［6］ 。因此，与正常体内肾小球系膜细胞生长状况相比，正常培养条件下体外培养的细胞仍处于过度增殖状态。系膜细胞增殖及分泌炎症介质、细胞外基质在肾小球损害中起重要作用，已被大量资料证实。现在，系膜细胞增殖与肾小球损害密切相关已成共识。系膜细胞对损伤的反应是增殖、发生表型改变并产生ＥＣＭ 的积聚，系膜细胞增殖往往是系膜硬化及肾小球硬化的前奏。有报道表明，细胞因子如ＩＬ －１， ＴＮＦ，ＩＧＦ， ＩＬ －６ 以及内毒素等［8］ ，可以激活系膜细胞。因此，在本实验中采用ＬＰＳ 做为刺激物，实验结果也表明ＬＰＳ 可以刺激肾小球系膜细胞的增殖。
         
       ＭＣ 增生可分泌多种活性物质，这些活性物质一方面可促进ＭＣ 增殖，另一方面又可作用于其他炎症细胞，加重炎症的扩展和恶性循环。多种刺激因素可导致ＭＣ 增生，增生的ＭＣ 可分泌多种细胞因子ＩＬ －１，ＩＬ －６，ＩＬ －８，ＴＮＦ 等，这些因子以自分泌、旁分泌的形式影响ＭＣ 的生物活性［9］ ，可促进ＭＣ 增生，促进病变的持续进展，最终导致肾小球硬化及间质纤维化。ＩＬ －１ 异常分泌可促进细胞增殖以及细胞外基质的产生，并能分泌胶原及含硫细胞外胶质，刺激肾小球脏层上皮细胞增生，合成ＩＶ 型胶原，刺激成纤维细胞，导致纤维化等效应［１0］ 。而ＩＬ －１β能由单核巨噬细胞、肾小球系膜细胞及血管内皮细胞等多种细胞产生［１1］ 。多种细胞因子对肾小球形成反复恶性刺激，致使肾小球成为“自毁式”靶器官，最终导致肾小球硬化和新月体形成［１2］ ，肾功能衰竭。
       
       自１９８７ 年日本学者Ｉｗａｍａ Ｈ ［１3］首先提出血清药理学的研究方法 以来，该方法一直被广泛运用于药理学的研究当中。其中给药剂量一直是血清药理学实验的一个难点问题。目前血清药理学实验中大多设高中低剂量，以便于含药血清量效关系的研究。但由于含药血清加入体外反应体系后，血药浓度会被稀释，故如何使体外反应体系中具有与在体条件下可比拟的药物浓度是血清药理学需要解决的一个问题。根据我们以往的经验，在本研究中，我们认为给药剂量为成人剂量／ｋｇ 的２０ 倍时较为合理［１4］ 。至于反应体系中含药血清浓度问题，一般认为含药血清浓度不宜过高，若超过某种限度，将对细胞或组织活动产生不利影响，其浓度以不超过２０％为宜［１5］ 。为了避免含药血清的细胞毒性，又不失含药血清的有效性，我们取１０％含药血清浓度作为实验用药浓度。
       
       本研究结果显示中药复方通脉口服液含药血清可以有效地抑制体外培养条件下肾小球系膜细胞的增殖，并且复方的作用要优于单味药材。ＥＬＩＳＡ 实验结果显示，在大鼠肾小球系膜细胞体外培养时经ＬＰＳ 刺激后ＩＬ －１β表达明显上升，系膜细胞明显增生，而加入通脉口服液含药血清后致炎症因子ＩＬ －１β表达量明显下降，提示肾小球系膜细胞是通脉口服液发挥治疗作用的重要靶细胞，抑制系膜细胞的过度增殖，减少致炎症因子ＩＬ －１β的表达， 阻断炎症反应在系膜区的进一步的扩大和循环，延缓肾纤维化可能是通脉口服液防治肾小球硬化的作用机制之一。
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