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       【摘要】 
       目的建立超声波提取鱼腥草多糖的最佳工艺。方法以多糖得率、多糖含量为指标成分，采用正交实验对鱼腥草多糖的超声提取工艺进行优选。结果最佳工艺为：鱼腥草料液比１∶３０，超声６０ ｍｉｎ，醇沉浓度为９０％。多糖得率及含量分别为１４．６１％，１２．２２％。结论该方法简便，准确，灵敏度高，适合于鱼腥草多糖的提取。
       【关键词】  鱼腥草 多糖 超声提取 正交实验
       Study on the Extraction of Polysaccharides from Houttuynia cordata by Ultrasonic Technology
       ＭＥＮＧ Ｊｉａｎｇ， ＺＨＯＵ Ｙｉｓｈｅｎｇ， ＬＩＡＯ Ｈｕａｗｅｉ
       （Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou， ５１０００６， China）
       Abstract:ObjectiveＴｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Houttuyniacordata．MethodsＴｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Houttuynia cordata ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｓ ｍａｒｋｓ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ．ResultsＴｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗａｓ ａｓｆｏｌｌｏｗｓ： Houttuynia cordata ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｔ ｓｏｌｉｄ －ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏｎ ｏｆ １：３０， ６０ｍｉｎ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｗｉｔｈ ９０％ ｅｔｈａｎｏｌ．Ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗｅｒｅ 14.61％ ａｎｄ １2．２2％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ConclusionＴｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｑｕｉｃｋｌｙ ａｎｄ ｈｉｇｈly ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ．
       Key words:Houttuynia cordata；  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ；  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ；  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ
       
       鱼腥草为三白草科Ｓａｕｒｕｒａｃｅａｅ 蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Ｔｈｕｎｂ．的新鲜全草和干燥地上部分［１］，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效。主要用于肺脓疡、痰热咳嗽、热痢热淋、痈疮肿毒［２］。本课题组曾对鲜鱼腥草ＧＣ －ＭＳ、ＨＰＬＣ －ＭＳ指纹图谱、黄酮类、酚类化合物的化学研究方面进行报道［３ ～６］。药理研究发现鱼腥草水溶性多糖对羟自由基和超氧自由基有较明显的清除作用［７］。但有关鱼腥草多糖的提取、工艺研究尚未见报道。超声波作为一种高效提取方法已经广泛地应用于各类化学成分的提取，为此我们对超声提取鱼腥草多糖工艺进行考察，采用正交实验法以多糖含量、得率为指标进行最佳工艺优选，以期找出合理可行的制备工艺。
       1  仪器与试药
       １．１  仪器电子天平（ＡＹ１２０，ＳＨＡＭＡＯＺＵ ＣＯＲＰＯＰＡＩＴＩＯＮ ＪＡＰＡＮ）、ＨＨ －６ －恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）、超声波清洗器（２５０Ｗ，上海之信仪器有限公司）、电热鼓风恒温干燥箱（３１００Ｗ，上海讯能电热设备有限公司）、ＵＶ －１８００ 紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；双Ｂ 循环水式多用真空泵（ＳＨＢ －ＩＶ，郑州长城科工贸有限公司）。
       １．2  试药葡萄糖标准品Ｓｉｇｍａ 公司产品；苯酚，硫酸、丙酮、乙醚、三氯乙酸、氢氧化钠试剂均为分析纯，医用乙醇（广州市新升华玻有限公司），苯酚试液参照文献［８］配制。
       
       鱼腥草购于广州清平市场，经广东药学院陈幼竹博士鉴定为三白草科蕺菜属植物Houttuynia cordata Ｔｈｕｎｂ．
       2  方法与结果
       ２．１  鱼腥草多糖的提取与精制取鱼腥草干品２００ ｇ，以９５％乙醇回流脱脂３ 次，药渣置通风处晾干，加水１０ 倍量、８ 倍量、８倍量，于９０ ～１００℃依次提取３，２，１ ｈ，过滤，合并滤液，浓缩至约２００ ｍｌ，加入等体积３０％三氯乙酸溶液脱蛋白，４℃静置，离心，上清液用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ 的氢氧化钠调ｐＨ ＝７，溶液减压浓缩，浓缩液对水透析，透析液减压浓缩至１００ ｍｌ，加入９５％乙醇调含醇量为８０％，静置，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次洗涤，真空干燥，得除蛋白精制鱼腥草多糖。
       ２．２  多糖含量测定方法的建立
       ２．２．1  标准品溶液的制备精密称取１０５℃干燥至恒重的葡萄糖０．０９６ ４ ｇ，加水溶解并定容至１００ ｍｌ，再取１ ｍｌ，定容至１０ ｍｌ的容量瓶中，即制得浓度为０．０９６ ４ ｍｇ／ｍｌ 的葡萄糖对照品贮备液。
       ２．２．2  供试品溶液的制备称取鱼腥草５０ ｇ ，按正交设计表进行提取，得粗多糖。称取１０５℃干燥至恒重的粗多糖约３０ ｍｇ，精密称定，置于１００ ｍｌ 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
       ２．２．３  标准曲线的绘制精密量取葡萄糖标准品溶液０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７ ｍｌ，分别置１０ ｍｌ 具塞试管中，加蒸馏水补充至１．０ ｍｌ，摇匀，加５％苯酚溶液１ ｍｌ，浓硫酸５ ｍｌ，室温放置４０ ｍｉｎ。另取１ ｍｌ 蒸馏水，加同量苯酚和浓硫酸，同法操作，作为空白对照。置ＵＶ －１８００ 型分光光度计中，于４９０ ｎｍ 测定吸收度，以吸收度（Ｙ）对葡萄糖含量（Ｘ）进行回归，得回归方程：Y＝９．１０７ ３ X ＋０．０１０ ２，相关系数r＝０．９９９ ８。结果表明葡萄糖在０．０１９ ３ ～０．０９６ ４ ｍｇ／ｍｌ 范围内呈良好的线性关系。
       ２．２．４  换算因素的测定精密称取６０℃干燥至恒重的鱼腥草多糖１０１．２ ｍｇ，置１００ ｍｌ 容量瓶中，加入少量蒸馏水溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取此液１ ｍｌ，照标准曲线制备项下的方法测定吸收度，从回归方程中求出多糖供试液中葡萄糖的浓度。按下式计算换算因素：F ＝W ／（C ×D）。Ｆ 为换算因素；Ｗ 为多糖重量（ｍｇ）；Ｃ 为多糖稀释液中葡萄糖的浓度（ｍｇ／ｍｌ）；Ｄ 为稀释因素。
       ２．２．５  样品测定方法取各供试品溶液，按标准曲线项下方法操作，测定吸收值，从回归方程中求出供试液中葡萄糖的含量，按下式计算样品中多糖含量：多糖含量（％） ＝C ×D ×F ×１００／W。C为供试液中葡萄糖的浓度（ｍｇ／ｍｌ）；D 为供试液的稀释因素；F为换算因素，W为供试样品重量（ｍｇ）。
       ２．３  正交实验法优化超声波提取鱼腥草多糖最佳工艺
       ２．３．1  制定因素水平表根据文献报道［９］并结合实际，超声波提取多糖的影响因素有超声时间、料液比、醇沉浓度，为此选择３因素作为考察因素，并结合生产实际，每因素又选取３ 个水平，按Ｌ９ （３４ ）正交表安排实验，以多糖得率及含量作为衡量提取效率的双重客观指标，优选最佳工艺，为了提高统计分析的可靠性，每一条件下都作了重复实验（n＝３），测定结果取其平均值供统计分析用。因素水平安排见表１。结果见表２。
       ２．３．2  加权法综合评价鱼腥草多糖提取工艺最佳提取条件要满足多糖得率高并且含量也高，因此采用加权评分法综合评估鱼腥草多糖提取条件。评分标准为：将各项指标除以该列最大值再乘以１００，为其该项得分。通过这样处理，使多糖得率和多糖含量转化为０ ～１００ 之间的数。根据多糖得率（ｘ）和多糖含量（ｙ）作用，而确定两者的权重系数分别为０．４ 和０．６，对两项指标进行加权求和，通过公式z ＝０．４x ＋０．６y，就得到综合评分（ｚ）。加权评分结果及方差分析见表２ ～３。
       表1  正交因素水平（略）
       表2  正交实验及结果（略）
       表3  方差分析（略）
       * 表示差异显著，F0.10( 2, 2)=9.00，F0.05( 2, 2)  =19.00
       2．３．３  结果分析正交实验方差分析表明，因素Ａ（超声时间）对鱼腥草多糖的提取有显著影响，而因素Ｂ（料液比）、因素Ｃ（醇沉浓度）对鱼腥草多糖的提取无显著影响。由Ｒｊ 得出影响因素大小顺序为Ａ ＞Ｃ ＞Ｂ ，由此得出最佳工艺为Ａ３ Ｂ１ Ｃ３ ，即鱼腥草料液比１∶３０，超声６０ ｍｉｎ，醇沉浓度为９０％。
       ２．３．４  验证实验按照理论最佳工艺Ａ３ Ｂ１ Ｃ３ ，进行重复实验，鱼腥草多糖得率及多糖含量分别为１４．６１％，１２．２２％，实验结果一致。
       ２．４  不同提取方法的比较
       ２．４．１  水煎煮提取鱼腥草多糖称取鱼腥草５０ ｇ，加３０ 倍体积的水，９０℃提取３ 次，２ ｈ／次，过滤，９０％乙醇醇沉得粗多糖，分别计算得率和多糖的含量。结果见表４。
       ２．４．２  碱法提取鱼腥草多糖称取鱼腥草５０ ｇ，加０．２ ｍｏｌ／Ｌ ３０倍体积的氢氧化钠水溶液，６５℃恒温水浴中浸提３ ｈ，过滤，滤液调ｐＨ 为中性，９０％乙醇醇沉得粗多糖，分别计算得率和多糖的含量。结果见表４。
       ２．４．3  酸法提取鱼腥草多糖称取鱼腥草５０ ｇ，加３０ 倍体积的水，调ｐＨ ＝３，６０℃浸提３ 次，３ ｈ／次，过滤，滤液调ｐＨ 为中性，９０％乙醇醇沉得粗多糖，分别计算得率和多糖的含量。结果见表４。
       ２．４．4  超声提取按该试验所得最佳工艺提取，即称取鱼腥草５０ ｇ，加３０ 倍体积的水，超声６０ ｍｉｎ，过滤，９０％乙醇醇沉得粗多糖，分别计算得率和多糖的含量，结果见表４。
       表4  不同提取方法比较（略）
       3  讨论
          
       通过实验确定了超声波提取鱼腥草多糖最佳工艺为鱼腥草料液比１∶３０，超声６０ ｍｉｎ，醇沉浓度为９０％。与水提、酸提、碱提方法进行比较，结果看出超声波提取多糖得率和含量略低于其它提取方法，但提取时间是酸提法的１／９，水提法的１／６，碱提法的１／３，大幅度降低成本；同时超声提取所得多糖颜色最浅，可降低下一步的脱色纯化的难度；另外超声提取全过程避免了高温加热，从而减少了酸碱对多糖结构的破坏，所用仪器简单，操作方便，因此也不失为一种好的提取方法。
       
       鱼腥草目前主要是开发挥发油类成分的制剂如鱼腥草注射液等相关产品，而对于水溶性多糖以废弃物处理，本实验对鱼腥草多糖的提取工艺研究对于鱼腥草资源的合理充分利用具有重要的意义。
       【参考文献】
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