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       【摘要】 
       目的对柿叶中总黄酮的提取工艺进行优选。方法采用正交实验法，以总黄酮含量（ｍｇ· ｇ－１ ）为指标，对乙醇浓度、溶剂量及提取次数和时间３ 种因素进行了研究。结果将柿叶最粗粉用２５ 倍８０％乙醇提取４ 次，可以获得较高的提取率。结论此工艺有效成分提取率较高，重现性好，稳定可行。
       【关键词】  柿叶 总黄酮 正交实验 提取工艺
       Study on the Extraction Process of Total Flavones in Persimmon Leaves
       ＺＨＡＮＧ Ｘｉｕｍｅｉ， ＺＥＮＧ Ｚｕｐｉｎｇ*， ＷＡＮＧ Ｙｏｎｇｈｏｎｇ
       （School of Traditional Chinese Medicine of Capital University of Medical Sciences，Beijing １０００１３， China；Beijing Institute of TCM， Beijing １０００１０， China）
       Abstract:ObjectiveＴｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｉｎ Ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ Ｌｅａｖｅｓ ．MethodsＴｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｗｅｒｅ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ａｓ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ ．ResultsＴｈｅ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｗａｙ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２５ ｔｉｍｅｓ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ８０％ ａｌｃｏｈｏｌ ｕｎｄｅｒ ｒｅｆｌｕｘ ｆｏｒ ４ ｔｉｍｅｓ．ConclusionＴｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｏｂｔａｉｎｓ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ．Ｉｔ ｉｓ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ．
       Key words:Ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｌｅａｖｅｓ；   Ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ；   Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ；   Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ
       
       柿树是我国的重要经济树种之一，柿叶为柿树科落叶乔木植物柿Diospyros kaki Ｌ．ｆ．的新鲜或干燥叶片。国内外研究表明，柿叶制剂、柿叶茶及柿叶提取物具有降压、利尿、抑菌、止血、降脂、抑制癌瘤生长等多方面的生理活性。现代研究表明，柿叶中的主要有效成分为黄酮类，大多以苷的形式存在［１］，其具有抗急性脑缺血损伤神经保护作用，对心血管系统有增加冠脉流量、降低血压、降低心肌耗氧量、改善全身血液循环作用，能增加小鼠对窒息性缺氧的耐力，并对大鼠急性心肌缺血有一定的保护作用。此外，柿叶黄酮还有抗氧化清除自由基、抗过敏、保肝［2］、抗炎、抗菌、抗肿瘤等功能，在防治中老年人脑动脉硬化、预防脑血栓形成、防治老年人痴呆和其它神经退行性疾病、皮肤抗衰老、美容等方面有广泛的开发应用前景［3］。为了有效利用柿叶所含的黄酮类物质，本实验以总黄酮含量为指标，采用正交实验优选了总黄酮最佳提取条件。
       1  仪器与试药
       １．１  仪器ＵＶ －２２０１ 紫外可见分光光度计（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）；倾斜式高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；ＰＢ２０３ －Ｎ 电子精密天平（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ 仪器上海有限公司）；ＡＪ１５０Ｌ 电子精密天平（Ｍｅｔｔｌｅｒ ｉｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
       １．２  试药实验用药材采自北京市昌平区，落叶晾干，经鉴定为柿树科柿属柿Diospyros Kaki Ｌ．ｆ．；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：０８０ －９３０３）；ＡｌＣｌ３ · ６Ｈ２ Ｏ 等均为分析纯。
       2  方法与结果
       ２．１  因素水平表乙醇作为提取溶剂，对乙醇浓度、溶剂量及提取次数和时间３ 种因素进行考察，每种因素分为３ 个水平，结果见表１。
       2.2  供试品溶液的制备精密称取柿叶最粗粉（１０ ～２２ 目之间）１ ｇ 共９ 份，按照表２ Ｌ９ （３４ ）正交实验设计方案，用对应浓度和体积的乙醇回流提取相应次数和时间。回流结束后合并提取液，放冷，抽滤，滤液转移至１００ ｍｌ 或２００ ｍｌ 量瓶中，分别以其相应的提取溶剂定容，过微孔滤膜（０．４５ μｍ），作为供试品溶液。
       表1  正交设计因素水平（略）
       表2   L9（34）正交实验设计及结果分析（略）
       2.3  对照品溶液的制备精密称取１２０℃干燥至恒重的芦丁对照品０．０８２ ５ ｇ 于１００ ｍｌ 量瓶中，７０％乙醇超声溶解，定容至刻度，得芦丁标准液０．８２５ ｍｇ· ｍｌ－１ 。
       2.4  显色试剂及测定波长的选择Ａｌ（ＮＯ３ ）３ －ＮａＮＯ２ －ＮａＯＨ显色法［４］ ：精密吸取芦丁标准液０．５ ｍｌ 和供试液１＃、４＃、７＃各适量至２５ ｍｌ 量瓶中，分别加入５％ＮａＮＯ２ １．０ ｍｌ，放置６ ｍｉｎ，然后加入１０％Ａｌ（ＮＯ３ ）３１．０ ｍｌ，混匀，放置６ ｍｉｎ，再加入４．３％ＮａＯＨ１０ ｍｌ，用７０％乙醇定容至刻度，放置１５ ｍｉｎ。在１９０ ～７００ ｎｍ 范围内扫描测定吸收光谱。
       
       ＡｌＣｌ３ 显色法［５］ ：精密吸取芦丁标准液０．１ ｍｌ 和供试液１＃、４＃、７＃各适量至１０ ｍｌ 量瓶中，分别加入０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＡｌＣｌ３·６ Ｈ２Ｏ １．０ ｍｌ，用５０％乙醇定容至刻度，摇匀，放置１５ ｍｉｎ。在１９０ ～７００ｎｍ 范围内扫描测定吸收光谱。
       
       比较上述两种显色法，用Ａｌ（ＮＯ３ ）３ －ＮａＮＯ２－ＮａＯＨ 显色后，明显生成红色絮状沉淀，此法不宜采用；而ＡｌＣｌ３ 显色后，芦丁标准液的λｍａｘ ＝４１０ ｎｍ，３ 个样品溶液的λｍａｘ＝４００ ～４１０ ｎｍ，故选择ＡｌＣｌ３ 显色后４１０ ｎｍ 测定吸光度。
       2.5  显色稳定性考察精密吸取芦丁标准液０．３ ｍｌ 和供试液４＃１．０ ｍｌ，依法显色后放置不同时间，测定吸光度，结果见表３，吸光度RSD 分别为０．２％和０．３％，可见芦丁标准液和供试液４＃显色后４ ｈ 内基本稳定。
       2.6  线性关系考察取芦丁标准液１．０ ｍｌ 置２５ ｍｌ 容量瓶中，用５０％乙醇定容至刻度，摇匀，分别取１．０，２．０，２．５，３．０，３．５，４．０ ｍｌ 置１０ ｍｌ 量瓶中，加入０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＡｌＣｌ３ · ６Ｈ２ Ｏ １．０ ｍｌ，用５０％乙醇定容至刻度摇匀，４０ ｍｉｎ 后于４１０ ｎｍ 处测定吸光度Ａ值，结果见表４。线性回归得标准曲线：A ＝５．６ ×１０－３ C ＋５．７ ×１０ －３ ，R ＝０．９９９ ９，线性范围为３３．０ ～１３２．０ μｇ／ｍｌ。
       2.7  样品测定分别取９ 份供试品溶液适量至１０ ｍｌ 量瓶中，加０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＡｌＣｌ３ · ６Ｈ２ Ｏ１．０ ｍｌ，用５０％乙醇定容至刻度，摇匀，４０ｍｉｎ 后于４１０ ｎｍ 处测定吸光度Ａ 值，换算为总黄酮含量（ｍｇ·ｇ－１ ），如表２ 所示，极差分析得最佳提取工艺为Ａ２ Ｂ２ Ｃ３ ，即８０％乙醇，２５ 倍量，提取４ 次（２，１．５，１．５，１ ｈ）。
       表3  显色稳定性考察（略）
       表4  芦丁标准曲线的制作（略）
       2.8  验证实验精密称取柿叶最粗粉（１０ ～２２ 目之间）１ ｇ ５ 份， 置于１００ ｍｌ 锥形瓶中，按照Ａ２ Ｂ２ Ｃ３ 条件提取，合并提取液，放冷，抽滤，滤液转移至２００ｍｌ 量瓶中，８０％乙醇定容至刻度，过微孔滤膜，测定样品中总黄酮的含量，结果见表５，其平均值为１０１．８２１ ｍｇ· ｇ－１ ，RSD ＝２．１％，表明此条件重复性良好。
       表5  验证实验结果（略）
       3  结论与讨论
       3.1  结论柿叶乙醇提取最佳工艺为Ａ２Ｂ２Ｃ３ ，即８０％乙醇，２５ 倍量，提取４ 次（２，１．５，１．５，１ ｈ）。经验证样品中总黄酮平均含量为１０１．８２１ ｍｇ· ｇ－１ （RSD＝２．１％），表明正交实验结果可靠。
       3.2  讨论
       3.2.1  预实验采用同一方法测定柿叶水提物和乙醇提取物中总黄酮含量，结果前者显著低于后者，根据参考文献及上述预实验结果，采用乙醇作为提取溶剂。
       3.2.2  ＡｌＣｌ３ 显色方法与参考文献比较未采用７０℃水浴，因为实际测定两者差异不大，不采用水浴可以减少测定步骤，减小误差。
       3.2.3  预实验采用２２ ～４８ 目柿叶粉回流提取，发现有爆沸现象，改为最粗粉１０ ～２２ 目。
       【参考文献】
         　　［1］ 郭 玫，董晓萍，徐文萍．柿叶的研究概况［Ｊ］．甘肃中医学院学报，２０００，１７（增）：７８．
       
       ［2］ 谭仁祥．植物成分分析［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２：４８６．
       
       ［3］ 贝伟剑，彭文烈，罗 杰．柿叶黄酮的大孔树脂分离提纯富集［Ｊ］．中成药，２００５，２７（３）：２５７．
       
       ［4］ 高梦祥，赵喜红．柿叶黄酮类物质的提取工艺研究［Ｊ］．陕西农业科学， ２００５（３）：４１．
       
       ［5］ 刘 斌，石任兵，周素蓉．苦参汤有效部位总黄酮含量测定方法研究［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２００４，１０（６）：２４．