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       【摘要】 
       目的优选护肝康片中水飞蓟总黄酮最佳纯化工艺。方法在考察纯化方法的前提下,采用正交实验法，以提取物中总黄酮量和水飞蓟宾的量为考察指标,考察影响水飞蓟素纯化因素。结果水飞蓟总黄酮最佳纯化工艺为采用8%浓缩液，3倍量体积醋酸乙酯萃取2次，10 min /次。结论优选的水飞蓟总黄酮纯化工艺稳定可行。
       【关键词】  正交实验 水飞蓟素 纯化工艺
       Study on the Optimum Purification Process of Silymarin in Hugankang Tablets by Orthogonal Design
       ZHANG Liang,XU Peihu*,ZHANG Xueqiong，XU Ke，GAO Yuan，ZHANG Shuangshuo
       (Wuhan University of Technology, Wuhan 430070,China)
       Abstract:ObjectiveTo optimize the purification process of total flavonoids from Silybum marianum.Methods On the premise of the best purification method, orthogonal test was used for studying the effect of silymarin purification with the contents of total flavonoids and silybin as index.ResultsThe optical conditions were as follows：3 times amount of ethyl acetate, 8% concentrated solution, extracting 2 times,10 minuters each time. ConclusionThe optimum purification technology of total flavonoids from Silybum marianum is stable and feasible.
       Key words:Orthogonal test;   Silybum;   Purification technology
        
       护肝康片由单方药材水飞蓟组成, 具有护肝保肝改善肝功能、降低血脂的功效, 可用于各型肝炎的治疗。水飞蓟为菊科植物水飞蓟Silybum marianum (L. ) Gaertn的果实。水飞蓟素( silymarin ) 是天然黄酮木脂素类化合物, 为水飞蓟的果实经提取精制而得的混合物。其主要成分为水飞蓟宾、异水飞蓟宾等。水飞蓟素作为抗肝损伤药物具有稳定细胞膜、改善肝功能的作用［1，2］。本实验对水飞蓟中黄酮类物质的纯化方法进行了研究，优化水飞蓟纯化工艺，为水飞蓟中总黄酮提取纯化提供科学依据。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器　UV1101型紫外分光光度仪（上海天美科学仪器有限公司），安捷伦1100高效液相色谱仪，旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），超声清洗器（天津赛恩斯科学仪器有限公司）。
       1. 2  药材与试剂　水飞蓟宾对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0856-200203) ,水飞蓟药材购自武汉红十字药业有限公司。分析纯甲醇、石油醚、醋酸乙酯，色谱甲醇。
       2  方法与结果［3,4］
       2.1  对照品溶液的制备精密称取水飞蓟宾对照品11.1 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度, 摇匀，即得。
       2.2  水飞蓟总黄酮的测定
       2.2.1  最大吸收波长确定精密量取水飞蓟宾对照品溶液5  ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。以甲醇溶液为空白溶液，在200～800 nm范围内扫描,得到其吸收光谱。结果表明在287 nm对照溶液具有最大吸光值，所以确定287 nm为测定波长。
       2.2.2  供试品溶液的制备精密称取水飞蓟提取物约0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液25 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
       2.2.3  标准曲线的制备精密吸取“2.1”项下对照品溶液2，4，6，8，10 ml，至10 ml量瓶中，分别加甲醇定容至刻度，在287 nm波长处测定吸收度。以对照品浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线，求解线性回归方程：A=0.043 7C＋0.017 7，r=0.999 9。线性范围为4.44 ～22.2 μg/ml。
       2.2.4  样品含量测定精密量取1 ml供试品溶液置25 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。以甲醇为空白液,在波长287 nm处测定吸光度，计算总黄酮的量。
       2.3  水飞蓟宾的测定
       2.3.1  色谱条件的选择色谱柱为Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm , 5 μm)，流动相为甲醇：乙腈：0.5%冰醋酸(40∶5∶55, 体积比)；检测波长287 nm；流速1 ml/min；柱温30 ℃。
       2.3.2   样品含量测定精密量取对照品溶液5 ml置10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取供试品溶液1 ml置25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。分别精密吸取对照品溶液与样品溶液各5 μl，注入液相色谱仪以外标法计算样品溶液中水飞蓟宾的含量。
       2.4  提取样品的制备称取水飞蓟药材300 g，粉碎，脱脂干燥，用10倍量90%的乙醇提取3次，1 h/次，分次过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至无醇味，加水定容至1 000 ml，摇匀。
       2.5   纯化方法比较分别采用萃取法和大孔树脂法纯化得提取物。萃取法：取100 ml浓缩液，用100 ml醋酸乙酯萃取两次，合并萃取液浓缩至干，得提取物。大孔树脂法：取100 ml浓缩液，上D101-1树脂柱，水洗除杂，然后用70%乙醇洗脱2倍柱体积，合并洗脱液浓缩至干，得提取物。紫外测定总黄酮含量和高效液相色谱法测定水飞蓟宾含量。结果见表1。
       
       由以上结果可知，采用萃取纯化方法得到的提取物总黄酮量和水飞蓟宾的量均比大孔树脂纯化高，因此采用萃取法对水飞蓟素进行纯化。
       表1  纯化方法比较结果（略）
       2.6  萃取条件优选根据影响萃取的主要因素，选择药液浓度（A）、萃取体积比（B）、萃取时间（C）、萃取次数（D）作为考察因素，每个因素取3个水平（见表2）。取水飞蓟浓缩液50 ml，设计L9(34)正交实验，以总黄酮的量和水飞蓟宾的量为考察指标，正交实验表设计见表3。对结果进行统计学处理，方差处理结果见表4～5。
       表2  工艺优化的因素水平（略）
       表3  L9(34)正交实验结果（略）
       表4  总黄酮测量结果方差分析（略）
       由表4总黄酮测量结果和方差分析可知，各因素对纯化效果的影响程度依次为D（萃取次数）> B(体积比)>A（溶液浓度）> C（萃取时间），D（萃取次数）因素影响差异有显著性，水总黄酮测量结果直观分析表明优化工艺应为A3B2C1D2。
       表5   水飞蓟宾测量结果方差分析（略）
       由表5水飞蓟宾测量结果方差分析可知，各因素对纯化效果的影响程度依次为D（萃取次数）> B(体积比)>C（萃取时间）> A（溶液浓度），D（萃取次数）因素影响差异有显著性，飞蓟宾测量结果直观分析表明优化工艺应为A2B2C3D2。
       
       综合总黄酮和水飞蓟宾测量结果方差分析结果，萃取次数和萃取容积用量对纯化效果有较大的影响，结合工业实际最终确定纯化工艺为：A3B2C1D2，即采用8%浓缩液，3倍量体积的醋酸乙酯萃取2次，10 min/次。
       2.7  验证实验为了考查所选择最佳工艺的稳定性,故对其实验条件进行验证, 并对其进行放大实验，取水飞蓟药材300 g粉碎，脱脂干燥，用10倍量90%的乙醇提取3次, 1 h/次，分次过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至无醇味，加水定容至1 000 ml，摇匀。取浓缩液250 ml 3份，按照最佳工艺条件A3B2C1D2平行3次实验。结果见表6。
       表6  纯化验证实验（略）
       由以上结果可知水飞蓟总黄酮的量和水飞蓟宾的量稳定且含量均较高，优选的工艺条件稳定可行。
       3  讨论
          
       实验曾采用固-液萃取和液-液萃取两种方法对水飞蓟提取物和提取液纯化，液-液萃取法操作更为简便而且萃取效果更好，相对固-液萃取更为减少工序节约能源，同时液-液萃取法生产能力大、便于连续和安全操作、易于实现自动控制等特点，使之更符合工业生产。
       
       采用液-液萃取纯化后，萃取液浓缩至干，由于水飞蓟含有大量油脂性成分，干燥的干膏中仍有部分油脂存在，因此采用石油醚对干燥提取物进行脱脂，采用3倍量石油醚浸渍提取物静置过夜，过滤，干燥得提取物。经石油醚处理的提取物测量总黄酮含量更为准确。
       
       根据最佳的提取工艺进行验证放大实验，验证工艺的稳定性和可行性，结果表明该工艺纯化水飞蓟总黄酮,含量较高，易于控制，稳定性好，适于工业化生产。
       【参考文献】
         　　［1］ 闫玉峰，于 健.水飞蓟的化学成分及药理研究进展［J］.中国药事，2000，14（5）：335.
       
       ［2］ 于乐成，顾长海.水飞蓟素药理学效应研究进展［J］.中国医院药学杂志，2001，21（8）：493.
       
       ［3］ 宋小妹，唐志书.中药化学成分提取分离与制备［M］.北京：人民卫生出版社，2004：143.
       
       ［4］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：56.