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       【关键词】  大黄总蒽醌
          摘要：目的：研究大黄提取纯化的工艺条件及参数。方法：以大黄总蒽醌的提取率及洗脱率为考察指标，考察大黄的提取条件及大孔吸附树脂富集、纯化大黄总蒽醌的吸附性能和洗脱参数。结果：大黄加水重沸煎煮3次，每次加水15倍量，20 min/次，有效成分可提取完全。通过大孔吸附树脂富集与纯化，用70%乙醇洗脱，总蒽醌的洗脱收率在80%以上，总固物收率明显降低至6.45%。结论：该实验所确定的提取及纯化工艺对大黄总蒽醌的富集是切实可行的。
        关键词：大黄；大黄总蒽醌；提取；纯化；大孔吸附树脂
        Study on Extraction and Purification Process of Total Anthraquinone in Rheum
        JIN Bo, LI Wei, CAI Wei
        (Institute of Materia Medica, Yangze River Pharmacy Group Taizhou, Jiangsu 225321, China)
        Abstract:Objective:To study the extracting conditions and purification process parameters of Rheum.Methods:The extracting conditions and adsorptive characteristics and elutive parameters of the process were studied by taking the extraction efficiency and purified ratio of Rheum as mark.Results:The optimum extracting condition was to add 15 times amount of water extract for three times, 20 minutes each time, the effective composition can be extracted completely. With macroporous adsorption resin to adsorb and purify, eluted with 70% ethanol, the elutive ration of total anthraquinone was above 80%, the solid matters were obviously reduced to 6.45%.Conclusion:The preparation process to extract and purity total anthraquinone was feasible.
        Key words:Rheum;Total anthraquinone;Extraction technology;Purification;Macroporous adsorption resin
        大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。主要产地是甘肃、青海，具有通里攻下、清热解毒、活血通瘀等多种功能。大黄中化学成分复杂，有蒽苷、芪苷、鞣苷等种类，其中蒽苷为最主要成分。大黄中羟基蒽醌衍生物总量约为2%～5%，分为游离蒽醌和结合蒽醌，包括大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素及其苷等［1］。其中游离蒽醌较少，呈酸性，可溶于乙醇、甲醇等有机溶剂中。结合蒽醌可溶于热水，也可溶于甲醇及乙醇中。大黄是重要的传统中药之一，对其研究报道较多，传统提取工艺一般采用水提或乙醇提取后，直接干燥成干膏而得。传统工艺虽然保留了大黄药材中的大部分有效成分，但出膏率较高，在解决中药粗、大、黑的问题上存在局限性。因此，采用现代工艺和技术对大黄有效成分进行提取及纯化将成为大黄制剂的重点目标。近年来，大孔吸附树脂在中药的提取、分离、富集方面广泛运用，不断受到药学研究者的重点关注。本实验参考相关研究资料对大黄进行了水提工艺及大孔吸附树脂纯化工艺的研究，对于大黄有效成分的富集方法具有一定的参考价值。
           1仪器与试药
岛津LC-10AT系列高效液相色谱仪，Class-LC10A色谱工作站；WLD大孔吸附树脂(四川省中药研究院提供)；大黄药材购自陕西宝鸡，经北京大学医学部药学院生物技术室郑俊华教授鉴定为蓼科植物掌叶大黄的根及根茎。大黄素对照品(批号0757-9804)，大黄酚对照品(批号0756-200211)，大黄素甲醚对照品(批号796-9302)，其余试剂均为分析纯。
           2方法与结果
        2.1大黄提取工艺研究大黄主要有效成分为蒽醌类，其中结合型蒽醌为泻下的主要成分。设计以水煎煮提取，以大黄所含的蒽醌类成分作为含量测定的指标，采用HPLC法进行测定。以煎煮次数、提取时间、加水量为三个因素，每因素分别设计三水平，选用L9(34)因素水平表，见表1。
表1正交实验因素水平（略）
        按照表1所确定的条件进行实验，提取液滤过，吸取续滤液，供制备供试品溶液。
        2.1.1含量测定
        2.1.1.1色谱条件［2］色谱柱为C18 ODS 4.6 mm×150 mm，5 μm；流动相为甲醇1%高氯酸水溶液(85∶15)；检测波长254 nm；流速1.0 ml/min。
        2.1.1.2游离蒽醌供试品溶液的制备［3］精密吸取相当于大黄药材0.1 g的提取液于100 ml圆底烧瓶中，烘干，第1次加氯仿30 ml，水浴加热(80℃)回流60 min，吸出上清液；第2次加氯仿25 ml，水浴回流30 min，吸出上清液；第3次加氯仿20 ml，水浴回流20 min，吸出上清液，反复提取至氯仿液无色，合并氯仿液，滤过，减压回收溶剂，残渣用乙腈溶解于2 cm量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液即得。
        2.1.1.3总蒽醌供试品溶液的制备［3］精密吸取相当于大黄药材0.1 g的提取液于100 ml圆底烧瓶中，烘干，加20%硫酸2.5 ml，室温振摇5 min，加氯仿30 ml，水浴加热(80℃)回流水解60 min，放冷至室温，吸出氯仿层；第2次加氯仿20 ml，振摇，放置10 min，吸出氯仿层；第3次加氯仿20 ml，振摇，放置10 min，吸出氯仿层，反复抽提至氯仿层无色，合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，滤过，减压回收溶剂至干，残渣用乙腈溶解于25 ml量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液即得。
结合型蒽醌含量=总蒽醌含量-游离型蒽醌含量
        按照上述测定方法，对正交实验各供试品溶液进样测定。结果见表2。
        表2正交实验测定结果实验（略）
        图1游离型蒽醌供试品HPLC色谱图
        图2总蒽醌供试品HPLC色谱图
        对上述实验结果进行直观分析，三个因素间主次关系为A＞C＞B。对上述实验结果进行方差分析。结果见表3。
        表3方差分析变异来源（略）
        根据上述方差分析的结果，煎煮次数有显著性差异，煎煮时间和加水量无显著性差异，考虑实际生产中工艺可行性、操作复杂程度、工时消耗、生产成本等因素，决定选用A3B2C3工艺条件，即取大黄加水重沸煎煮3次，每次加水15倍量，20 min/次。
        2.1.2验证实验由于优选的工艺未包括在正交设计表2的实验中，故对其进行了验证实验。用同一批药材，分别按A3B2C3进行3次实验。结果见表4。验证结果与实验结果基本一致。
        表4大黄提取验证(相当于生药mg・g1)（略）
        2.2大黄精制工艺研究我们采用大孔吸附树脂对提取液中水溶性成分进行吸附富集，用70%乙醇洗脱，能够保留大部分有效成分，且干品不易吸潮，取得满意效果。
        2.2.1大孔吸附树脂与药材比例的确定我们采用薄层色谱法，以大黄所含的蒽醌类成分为指标，检测经树脂吸附后的流出液，当流出液中出现蒽醌类成分，即可以确定药材与树脂的比例。
实验方法：按照确定的提取工艺制备提取液，从树脂柱(内含大孔吸附树脂150 g)上端加入，从下端收集流出液，每隔一定的体积取样，检测。结果当加入提取液超过相当于37.5 g药材时，流出液中即可检出大黄酸或其蒽醌类成分，即确定药材与树脂的比例为1∶5。
        2.2.2洗脱用乙醇浓度筛选分别选用50%，70%，90%三种乙醇浓度洗脱树脂，用HPLC法测定提取液和洗脱液中蒽醌类成分含量。
实验方法：取相当于大黄药材30 g的提取液，通过大孔吸附树脂(内含大孔吸附树脂150 g)，提取液全部加入后，加入水300 ml冲洗，用一定浓度的乙醇350 ml洗脱，再加水200 ml冲洗，收集洗脱液，混匀，计算干膏收率及总蒽醌洗脱率。结果见表5。
表5洗脱用乙醇浓度筛选%乙醇浓度   总蒽醌洗脱率   干膏收率50   61.02   6.1170   81.27   8.1590   80.24   7.31
以上数据说明用50%乙醇洗脱收率较低，70%乙醇和90%乙醇洗脱收率差别不大，均大于80%，决定采用70%作为洗脱用乙醇浓度。
        2.2.3洗脱乙醇用量筛选提取液通过大孔吸附树脂柱，用70%乙醇450 ml洗脱，收集洗脱液至150 ml开始取样，以后每50 ml取样1次，共450 ml，测定结果见表6。
上述数据说明，用70%乙醇洗脱，可将80%左右的有效成分解吸附，乙醇用量300 ml时，即可达到洗脱总量98%以上，决定使用300 ml 70%乙醇洗脱，即相当于一倍柱体积。
        2.2.4结论经以上实验确定大黄提取部分精制工艺为：经大孔吸附树脂富集有效成分，用一倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇浓缩至清膏，即得。
           3讨论
        3.1大黄的药理作用机理被广泛研究，尤其对大黄的泻下作用研究较多。对于大黄的提取自古就有“不宜久煎，入汤剂宜后下”的要求，认为起泻下作用的是结合蒽醌，煎煮时间过长会使结合蒽醌遭到破坏。本次实验通过对大黄水提工艺的研究发现，大黄加水重沸煎煮3次，每次加水15倍量，20 min/次，即可将大黄中蒽醌类成分提取完全，且提取时间延长，有效成分提取率并无提高，甚至有所降低，正好验证大黄不宜久煎的说法。
        3.2大孔吸附树脂具有吸附快、解吸高、吸附容量大、洗脱率高等优点，本实验通过对大黄提取液进行纯化研究，表明用70%乙表6洗脱乙醇用量结果（略）
        醇对上柱液进行洗脱，总蒽醌的洗脱收率在80%以上，同时提取液的干膏收率由37.61%降至6.45%，其干燥粉末具有较低吸潮率的特点。该方法在分离纯化大黄中有效成分方面具有一定的价值。
        3.3WLD型大孔吸附树脂以苯乙烯为聚合单体，二乙烯苯为交联剂，属于D-101类型，由于在合成树脂过程中，树脂表面及空隙中含有未聚合单体、致孔剂、交联剂等残留物，因此使用时需进行预处理。本次试验采用2%NaOH溶液浸泡4 h，用蒸馏水洗至中性，再用2%的盐酸乙醇浸泡4 h，酸醇洗脱，再用蒸馏水洗至无醇味，可保证树脂柱重金属、有机溶剂残留等符合要求。
           参考文献：
        ［1］尚崇厚.中药化学［M］.上海：上海科学技术出版社，1997：218219.
        ［2］富戈，徐秉玖，陆艳，等.唐古特大黄中五种游离和结合蒽醌各自含量的测定［J］.北京医科大学学报(增刊)，1998，30(6)：2021.
        ［3］宗玉英，余满堂，朱志强，等.胶束电动毛细管色谱法分离和测定几种大黄含量［J］.药学学报，1995，30(8)：594598.
        (扬子江药业集团药物研究所，江苏 泰州225321)