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       【摘要】 
       目的为采用随机扩增多态性技术鉴别绞股蓝及其易混品乌蔹莓，进行RAPD条件摸索。方法运用改进CTAB法提取七叶绞股蓝、五叶绞股蓝、乌蔹莓以及烟草基因组DNA，摸索影响RAPD的条件。结果用改进CTAB法提取所得的DNA质量较好，均能用于RAPD扩增，并摸索出了最优RAPD扩增条件。结论改进的CTAB法适合于这4种植物的DNA提取，摸索得到的RAPD扩增条件可用于绞股蓝种类鉴别及与其易混品乌蔹莓的区别。
       【关键词】  绞股蓝 基因组DNA 随机扩增多态性DNA 鉴别
       Exploration of Conditions for the Identification of the Variety of Gynostemma pentaphyllum with RAPD Method
       LUO Yu, LI Xiongying, WU Yaosheng, JIANG Junfu, ZHAO Ruiqiang, ZENG Qiyan
       Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangxi Medical University, Nanning Guangxi 530021, China
       Abstract:ObjectiveTo explore the conditions of the differentiation of Gynostemma pentaphyllum from the mixed plant, Cayratia japonica with RAPD technology. MethodsThe improved CTAB method was used to extract the genome DNA from Jiao Gu Lan(Gynostemma pentaphyllum) Seven Leaves Jiao Gu Lan, Cayratia japonica and Tobacco, respectively. The optimum conditions of RAPD were researched. ResultsWith the improved CTAB method, the extracted DNA presented better quality and could be used to progress RAPD. The optimum conditions for RAPD have been successfully explored. Conclusion The improved CTAB method is suitable to extract genome DNA from the four medicinal plants, respectively, and the conditions explored with RAPD technology can be used to identify the variety of Gynostemma Pentaphyllum and distinguish it from the mixed plant, Cayratia japonica.
       Key words:Gynostemma pentaphyllum;  Genome DNA; RAPD;  Identification
       绞股蓝Gynostemma pentaphyllum，(Thunb) Makino系葫芦科绞股蓝属多年生攀缘草质藤本植物。绞股蓝具有较广泛的生态适应性，自然分布于秦岭及长江以南的15个省区。绞股蓝全草入药，有清热解毒、镇咳祛痰、抗癌、降血脂、防衰老、抗疲劳等功能，临床上应用于老年慢性支气管炎、哮喘、胃肠炎和传染性肝炎等疾病的治疗。从绞股蓝属植物中分离出的84种皂苷中有6种与人参皂苷的四环三萜达玛烷型结构完全相同，所以有“南方人参”的美誉。
       RAPD（random amplified polymorphic DNA）技术是1990年由Williams和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态检测技术。RAPD具有不需要使用同位素、无需知道基因组DNA序列信息、操作过程简便、快速等优越性，它是众多分子标记中应用最广的一种［1，2］，在动植物的遗传多样性检测、品系鉴定、遗传图谱构建和系统学研究等领域已得到了广泛的应用［3，4］。
       本实验通过摸索影响RAPD扩增的几个主要因素，找出最优扩增条件，试图在DNA水平上构建绞股蓝的分子标记，为绞股蓝种类鉴别及与其易混品乌蔹莓的区别提供理论依据，也为更好地利用绞股蓝这一药用植物提供帮助。
       1  器材
       1.1  材料 
       绞股蓝Gynostemma Pentaphyllum，(Thunb) Makino和乌蔹莓Cayratia japonica (Thunb) Gagn由广西药用植物园凌征柱教授提供；烟草（Tobacco）由中国科学院上海植物生理生态研究所提供。因绞股蓝掌状叶片常有五枚小叶，本文中称为五叶绞股蓝；另外，采集了另一种掌状叶片均为七枚小叶的绞股蓝，本文中称为七叶绞股蓝，其种类待鉴定。
       1.2  仪器
       电泳仪（DYY-10C型，北京六一仪器厂）；SmartspecTMplus核酸蛋白测定仪（Bio-RAD Lab，Inc，USA.）；MyCyclerTM PCR仪(Bio-RAD Lab, Inc，USA.)；UVI-7600Z凝胶成像系统。
       1.3  试剂
        
       CTAB，BSA（牛血清白蛋白），琼脂糖，10碱基引物均购自上海生工生物工程有限公司；Taq酶，dNTP，MgCl2均购自宝生物工程（大连）有限公司。
       2  方法
       2.1  基因组DNA的提取
       采用CTAB法，参照陈莉等［5］方法加以改进。具体操作：①新鲜叶片液氮中过夜，加液氮进行研磨至细粉末状后，迅速转入离心管中；加65℃预热1.5×CTAB提取缓冲液［1.5%CTAB，75 mmol/L Tris-HC1 (pH8.0)，15 mmol/L EDTA (pH8.0)，1.05 mol/L NaCl］混匀，65℃水浴20 min；取出冷却至室温，6 200 r/min离心10 min。②收集上清液，加等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）混匀，6 200 r/min离心10min。再收集上清液，加1/10体积1×CTAB提取缓冲液（1% CTAB，0.7 mol/L NaCl）及等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）混匀，6 200 r/min离心10 min；重复1次。③上清液加入等体积1×CTAB沉淀缓冲液［1.0%CTAB，50 mmol/L Tris-HC1(pH8.0)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)］混匀，65℃水浴30 min。冷却至室温，6 200 r/min离心10 min。弃上清液，加0.5 ml 1 mol/L NaCl，沉淀完全溶解后加2.5倍体积预冷无水乙醇，混匀。-20℃下静置15 min，5 200 r/min离心5 min。弃上清液，加70%乙醇漂洗沉淀2次，沉淀自然挥干。④最后加300 μl灭菌ddd H2O或TE（含10 mmol/LTris-HCl，1 mmol/LEDTA，pH8.3），溶解后作为母液DNA于-20℃下储存。各取基因组DNA母液5μl在1.5%琼脂糖凝胶上，100v恒压电泳15 min，检验能否获得DNA。将DNA母液取出10 μl稀释11倍后，用核酸蛋白测定仪测波长260 nm，280 nm处吸光值，直接从仪器主屏上读出被测样品A260，A280，A260/A280和DNA含量，以确定提取总DNA的纯度及浓度。最后将DNA母液稀释为60 ng/μl左右的工作液分装成小包装于- 20℃储存或4℃保存备用。
       2.2  PCR扩增及电泳检测
       反应在PCR扩增仪上进行，使用25μl反应体系，其成分为：10×Buffer 2.5 μl，25 mmol/L Mg2+2 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，10 μmol/L10碱基随机引物各1 μl，TaqDNA聚合酶1U，模板DNA60 ng左右。反应程序：预变性94℃3 min；扩增程序：94℃ 30 s，38℃ 30 s，72℃ 80 s，40个循环；然后72℃补充延伸10 min，4℃保存。取扩增产物7 μl在1.5 %琼脂糖凝胶上，100 v恒压电泳20 min，电泳结束后在UVI-7600Z凝胶成像系统上观察并照像。
       3  结果
       3.1  植物基因组DNA提取方法的改进由于不同药用植物所含的成分及其次生代谢物不尽相同，在提取DNA时，当前还没有统一方法适用于所有植物DNA的提取。本实验应用改进CTAB法，成功提取了七叶绞股蓝、五叶绞股蓝及烟草叶片基因组DNA，而对乌蔹莓提取时由于上清液黏稠且颜色深，故再行改进：研磨时加一定量PVP，破膜前，先用不含CTAB缓冲液把核外的多酚、多糖等杂质除去，同时加β-巯基乙醇（终浓度为2%）及少量活性炭，其它步骤与方法中所述的操作一致。最终成功提取了这4种植物的基因组DNA。
       3.2  植物基因组DNA琼脂糖电泳、DNA纯度及含量检测结果采用改进CTAB法所提的DNA颜色均为透明的白色、干后无色，说明质量较好。由图1可见，七叶绞股蓝、五叶绞股蓝、乌蔹莓及烟草叶片DNA在点样孔附近均有一条亮且集中的条带，说明DNA未降解；亮带前面的条带经RNase处理后不再存在，可用于RAPD扩增。
        经核酸蛋白测定仪测A260，A280。由表1可看出，A260和A280比值在1.846～1.905之间，DNA浓度在89～419 μg/ml之间，产率在197.1～921.8    μg/g之间。表1  基因组DNA纯度及含量检测（略）
       3.3   RAPD扩增条件探索
       3.3.1  退火温度的选择 
       变性温度和延伸温度一般分别为94℃和72℃，本实验首先将这两个温度确定下来，依照方法中所述的反应体系和扩增程序，仅改变退火温度，分别为38，40，45℃，用筛选来的一组引物对七叶绞股蓝、五叶绞股蓝进行扩增。
       由图2可见，45℃时扩增条带最少，38℃和40℃时扩增出来的条带相似，且重复性均较好，但由于所选的10碱基引物Tm均在36.90～41.00℃之间，更低温度对扩增有利，而当在40℃以上会抑制PCR产物［2］，条带减少，所以确定38℃为本实验最终的退火温度。
       3.3.2  Mg2+浓度的选择 
       PCR反应中的缓冲液是一个重要的影响因素，特别是其中的Mg2+能影响反应的特异性和扩增片段的产率［6］。本实验设计了一系列Mg2+浓度，分别为1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mmol/L，依照方法中所述的反应体系和扩增程序，对七叶绞股蓝进行扩增。由图3可见，当Mg2+浓度为2.5～4.0 mmol/L之间范围时，虽其中大部分浓度下扩增条带均清晰，但得到的条带明显比Mg2+浓度为1.5 mmol/L或2.0 mmol/L时少；而2.0 mmol/L扩增条带清晰，1.5 mmol/L扩增条带多但较为模糊，故确定2.0 mmol/L为本实验RAPD扩增的最适Mg2+浓度。
       3.3.3  BSA的用量对RAPD扩增的影响
       对植物进行RAPD扩增时，先建立稳定的反应体系，有助于RAPD结果的可靠性与重复性。在合适的扩增条件下，为了获得更理想的实验结果，有研究报道［7］在RAPD反应成分中添加酶保护剂，如BSA。本实验在反应体系中添加了一系列不同浓度BSA，分别为0，0.5，1，2，3，4，5 μg/μl，且设立空白对照（即不加模板），可使RAPD扩增片段明显增加，不同BSA用量对扩增影响的结果见图4～7。
       不同浓度的BSA对这4种植物RAPD扩增的影响不尽相同。在七叶绞股蓝、五叶绞股蓝扩增体系中，BSA浓度为1 μg/μl对RAPD扩增效果的改善最明显。当BSA浓度小于1 μg/μl时条带有但亮度略弱，且部分弱带扩增不够；当浓度在1～4 μg/μl范围内对扩增效果影响不大；当BSA浓度变为5 μg/μl时，扩增条带的亮度明显减弱，条带亦见减少。
       在乌蔹莓扩增体系中，未加BSA时RAPD无明显扩增，当BSA浓度为0.5 μg/μl时扩增效果有所改善但条带少且模糊；当BSA浓度为1，2 μg/μl时对扩增效果最好，条带多且清晰；当在3～5 μg/μl范围内，扩增条带的亮度明显减弱且条带减少、模糊。本实验BSA的浓度变化范围与文献中应用的BSA浓度相差不大，如边才苗等［7］在水杉RAPD扩增中应用0.6 μg/μl就可达到最佳扩增效果，而在七子花中BSA浓度至少需达到1 μg/ μl才可获得最佳的效果。国外也有文献报道［8］以0.25 μg/μl为最适浓度。我们确定用浓度<3 μg/μl，因为当浓度≥3 μg/μl时发现RAPD产物呈乳白色，溶液有不同程度的浑浊，对电泳的加样有明显的影响，且电泳后观察，加样孔处出现较亮的荧光，因此在植物RAPD反应体系中添加BSA的最适浓度需要经过摸索才可确定。                       
       4  讨论
       要进行植物DNA的提取，一般先将样品置于液氮中过夜，然后在液氮中研磨，使样品易于充分研磨，可提高DNA提取率，方便后续工作。 
       本实验采用改进CTAB法对七叶绞股蓝、五叶绞股蓝及烟草的基因组DNA进行提取，得到了质量较好的DNA；由于乌蔹莓DNA可能含更多的多糖和多酚类杂质，不适合用该改进方法，再行改进才能提取到质量较好的DNA。由于植物成分的复杂性及多变性，当前还没有那种提取方法对所有植物均适用。因此对某一种属或某一种植物来说，摸索出合适的提取方法是必不可少的。
       从实验结果看，退火温度在一定的范围内(2～5℃)变动，对RAPD扩增影响不是很大，这与Williams ［2］得出的结论相一致。如扩增反应对退火温度要求在某一温度，说明扩增条件还没有达到优化，需要进一步改善，否则实验结果还是不稳定的。因此，在优化 RAPD扩增条件过程中，应尽可能找出各种条件对RAPD扩增产生不良影响的高低变数［9］。
       Mg2+是TaqDNA聚合酶实现其聚合反应所必需的，且影响反应的特异性和扩增效率。本实验摸索得到的Mg2+最佳浓度为2.0 mmol/L，与文献报道的终浓度1.5～2.0 mmol/L［6］是相一致的。所确定的浓度虽仅在七叶绞股蓝中摸索，但应用于其它3种植物也能得到较好的扩增效果。
       由于经抽提纯化的植物DNA中还含有一定量的杂质，如多糖、多酚类化合物等，往往会影响 PCR扩增反应。添加适量的BSA可以封闭这种影响［8］，同时添加BSA还可以降低Taq酶的用量［7］。因此在植物RAPD扩增中，添加BSA是一种既经济又有效的辅助措施。本实验从不同浓度的BSA对4种植物RAPD扩增反应的不同影响，可看出BSA在一定范围内是可以改善RAPD扩增效果的，但加入的用量应根据不同植物而作适当调整。
       5  结论
       通过对绞股蓝及其易混品乌蔹莓，用改进的CTAB法提取DNA，均可用于RAPD的扩增。
       对RAPD扩增的主要条件进行了摸索，最终确定了RAPD扩增七叶绞股蓝、五叶绞股蓝及乌蔹莓DNA的最优条件。从结果看，不同种类绞股蓝及其易混品乌蔹莓的RAPD扩增所得的条带，其主带亮度、位置，条带数目不尽相同，故为绞股蓝在种类鉴别及与其易混品乌蔹莓区别上提供了实验性的依据，为更好地利用绞股蓝这一药用植物提供了一定的帮助。
       本实验对新鲜叶片基因组DNA提取及RAPD扩增条件的优化进行了摸索。而药用植物大多经过复杂加工后才用于临床，有些也在日常生活中使用，如绞股蓝常被加工成绞股蓝茶。因此，对绞股蓝以及其易混品乌蔹莓的加工品基因组DNA提取和RAPD扩增还有待进一步研究。
       【参考文献】
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