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       【摘要】 
       目的建立HIV-1 Tat蛋白结合Tar的抗HIV-1药物筛选模型用于抗HIV药物筛选。方法构建表达HIV-1 Tat 蛋白的真核表达质粒（pCDNA3.1(+)-Tat）和HIV-1 LTR-luc荧光素酶报告基因，采用脂质体转染法共转染HeLa细胞，荧光仪检测Tat蛋白促进荧光素酶在HeLa细胞内的表达情况，建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的细胞模型，用于抗HIV-1 的药物筛选。以DRB（5,6- 二氯- 1- β- 呋核亚硝脲-苯并咪唑）为阳性对照，进行模型的建立及条件的优化。结果通过反复试验表明，目的基因和报告基因的配比、转染时培养液中小牛血清的含量、细胞浓度、转染前细胞状态以及药物作用时间的长短等对模型的稳定性和敏感性有影响。结论应用优化的细胞模型对文冠果、紫苏等浸提物进行筛选及结果的分析。
       【关键词】  HIV-1 Tat LTR-Luc荧光素酶基因 艾滋药物筛选模型
       The Establishment of HIV-1 Tat Protein Binding Tar Model for Screening HIV-1 Inhibitors
       LI Zailiu, LIU Chaoqi, ZOU Kun1, LI Fenglan, HAN Yu, YANG Fan, WANG Leili
       1. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research & Development CTGU, Hubei Yichang 443002, China;
       2. Biology College, Beijing Forestry University, 100083, China;
       3. Institute of Molecular Biology CTGU, Hubei Yichang 443002, China
       Abstract:ObjectiveTo establish HIV-1 Tal binding to Tar model. MethodsHIV-1 Tat protein eukaryotic expression plasmid （pCDNA3.1(+)-Tat）and luciferase report gene HIV-1 LTR-luc(LTR-LUC) were constructed and transfected into HeLa cells with lipofectamine 2000. The expression of HIV-1 Tat protein in HeLa cells was detected with Iuminometer. HIV-1 Tat protein binding tar model for screening HIV-1 inhibitors was thereby constructed.Results The abstractions of Xanthoceras sorbifolia and Perilla frutescens and so on were detected and DRB(5,6-dichloro-1-β-D-robofuranosylbenzimidazole) was positive control. The stability of the model was tested and regulated. ConclusionThe repeated experiments indicate that the matching of  purpose gene and report gene, the rate of new calf serum in medium during transfection , density of the transfected cells, condition of the untransfected cells and the action time of drugs affect the stability and sensitivity of the model.
       Key words:HIV-1 Tat;   LTR-Luc luciferase gene;   Model for screening
       人类免疫缺陷病毒（HIV）是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原体；是一种逆转录RNA病毒，被称为“20世纪的瘟疫”，在全球广为传播，至今尚无根治药物。现已批准上市的药物（HIV蛋白酶、逆转录酶抑制剂）只能缓解病痛，价格昂贵、毒副作用大，病毒易产生变异性、耐药性，药效较差、抵消等［1，2］。因此，从艾滋病病毒的基础研究中寻找新的不易产生耐药性的靶点成为国内外研究热点。目前抗 HIV 药物的研究重点集中在逆转录酶、蛋白酶、整合酶及病毒吸附、融合等几个靶点。HIV反式激活因子(transactivator，Tat)作为HIV的调节蛋白，不仅可以通过反式激活效应调控病毒基因的复制与表达，还可以诱导细胞凋亡，激活静态T淋巴细胞，抑制免疫细胞的分化和增殖，有助于病毒的感染和体内传播，导致各种并发症等［3，4］。Tat 与反式激活效应区（trans- activator responseregion，TAR）RNA 相互作用，反式激活转录。Tat 和TAR 的结构具有高度保守性，使它成为寻找新的作用机制和不易产生耐药性的抗艾滋病药物的非常有吸引力的新靶点［5］。
       Tat 基因编码蛋白可与HIV-1 病毒长末端重复序列（LTR）结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译，导致病毒的复制增加［6］。本研究通过建立HIV-1 Tat 和LTR的结合，导致报告基因荧光素酶在细胞内的高表达，反映Tat 和LTR序列的有效结合，建立Tat的反式激活效应调控病毒基因的复制与表达模型，从而用于天然药物有效成分的筛选，具有简单、快速、微量、费用低廉、安全、不受P3实验室限制，不用同位素等特点，可为实验室建立抗HIV-1药物筛选模型提供借鉴与指导，具有较强的实践意义。
       1  材料与方法
       1.1   材料
       HIV-1 Tat 蛋白的真核表达质粒pCDNA3.1(+)-Tat及报告基因 HIV-1 LTR-luc(LTR-LUC)由三峡大学分子生物学研究所构建保存。 HeLa细胞株由北京协和医科大学惠赠。Lipofectamine 2000、Opti-MEM培养液均为Invitrogen公司试剂，新生牛血清（NCS）为GIBCO公司产品。DMEM培养基、胰蛋白酶、底物Luciferin、阳性对照DRB，细胞裂解液1,2-diaminocylclohexane-N,N,N,N-tetraacetic acid，考马斯亮兰等药品均为Sigma公司产品。
       1.2 方法
       构建表达HIV-1 Tat 蛋白的真核表达质粒（pCDNA3.1(+)-Tat）、HIV-1 LTR-luc荧光素酶报告基因，采用脂质体转染法共转染HeLa细胞，荧光仪检测Tat蛋白在HeLa细胞内的表达情况，建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的抗HIV-1的药物筛选模型。转染后的细胞加入对细胞毒性在20%以下的药物浓度，以DRB为阳性对照（Tat/Tar抑制剂，Mancebo et al., 1997; Nekhai et al，1997），培养一定时间后收集细胞裂解液上清检测相对荧光值（RLU），考马斯亮兰（G-250）测定蛋白含量，在蛋白含量统一的条件下，药物对Tat蛋白表达的抑制作用表现为药物组与空白对照组RLU的差值。
       1.2.1  HeLa细胞脂质体转染实验按 Lipo fectamine 2000的说明书进行操作：①转染前1天HeLa细胞以2×105cells/ml 浓度接种到24孔板，0.5 ml/孔，置37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。②转染前1h对待转染细胞换等体积、新鲜、不含抗生素的DMEM培养液，置37℃，5%CO2培养箱中孵育1h。③DNA-Lipofectamine共沉淀物的制备：A：pCDNA3.1(+)-Tat与LTR-Luc的稀释与混合：pCDNA3.1(+)-Tat与LTR-Luc浓度均为0.1 μg/μl，二者按一定配比共同稀释入Opti-MEM培养液。B：Lipofectamine的稀释：用Opti-MEM根据需要稀释后于室温放置5 min。C：将制备好的A液与B液混合，缓缓抽打混匀，室温放置20 min。D：将C液缓缓加入待转染HeLa细胞中，混均，孵育4～6 h。E：弃上清液，换新鲜的完全DMEM培养液，孵育16～48 h。F：结果检测：弃上清液，加入一定量的细胞裂解液，收集细胞上清液加入相应的荧光酶底物，荧光仪检测RLU，并用考马斯亮兰（G-250）法测定蛋白含量。
       1.2.2   HIV-1 Tat 蛋白结合Tar的抗HIV-1药物筛选模型的构建经以上实验建立方法后，进行药物筛选。具体方法为：“1.2.1”项③E步骤中换DMEM后，将对细胞抑制率在20%以下的不同梯度浓度的DRB及待测药物加入细胞中，继续孵育40 h，细胞裂解液裂解细胞，取上清液10 μl与底物luciferin100 μl，Sirius Berthold luminemeter 荧光仪检测结果。
       1.2.3  HIV-1 Tat 蛋白结合Tar的抗HIV-1药物筛选模型的稳定性优化实验通过多次实验发现模型稳定性较差，药物抑制作用不显著。为此，对模型进行了诸多因素调试。具体方法为：DRB为阳性对照，以空白组为阴性对照，以文冠果种皮、紫苏浸提物的水溶物为待测药，设立3个复孔，3次重复实验，通过改变目的基因与报告基因的配比、转染时培养液中小牛血清的含量、转染后细胞接种数量（确定两种重组质粒配比后采用细胞培养瓶以3×105细胞/ml 浓度传代，6 ml/瓶）、药物含量、转染前细胞状态以及药物作用时间的长短等因素进行模型稳定性研究。
       2  结果与分析
       2.1  脂质体转染结果采用改变pCDNA3.1(+)-Tat与LTR-Luc的总含量及配比（如表1）进行转染HeLa细胞，以调节RLU值在104～106范围内，并检验两种重组质粒对转染过程的影响，进一步验证两种质粒构建的成功性。结果如图1所示。
       从表1和图1可看出：①RLU值随着两种质粒总量的增加而显著增加，当两种质粒都为0（对照）时，RLU值极低，即：未转染；当两种质粒的含量达20 μl时，RLU值可达3×108，且随着LTR-Luc含量的降低而明显降低，但不由其决定，因为当LTR-Luc含量均为10 μl，而pCDNA3.1(+)-Tat的含量由10 μl变为0时，其RLU值降低了100倍，充分说明LTR-Luc的表达需要pCDNA3.1(+)-Tat刺激。②当pCDNA3.1(+)-Tat为3 μl，LTR-Luc为1ul时，RLU值为5459851可作为较佳的配比，初步建立模型。表1  pCDNA3.1(+)-Tat与LTR-Luc不同含量、不同配比转染HeLa细胞所得结果（略）
       2.2  模型的稳定优化实验结果
       2.2.1  初建模型加药筛选实验结果以pCDNA3.1(+)-Tat 3 μl，LTR-Luc1 μl转染HeLa细胞，加入文冠果、紫苏等浸提物，以DRB为阳性对照，加入对HeLa 细胞毒性在20%以下的药物浓度，结果如图2所示。
       
       从图2可看出，文冠果等药物对Tat蛋白无明显抑制作用，部分药有促进作用，阳性对照DRB也无明显的抑制作用，经过重复实验，结果依然。
       2.2.2  重组质粒的配比优化实验结果从上述结果可看出，pCDNA3.1(+)-Tat 3μl，LTR-Luc 1μl两种重组质粒的转染率高，Tat蛋白表达量高，可能导致了药物失效，为此，对两种质粒作梯度稀释后，进行拉丁方设计配比，所得RLU值如表2所示。
       表2所得结果再次验证了表1中结果。其中a1b2，a2b2组合所得RLU值相对其它组合值较适中，对其进行药物筛选实验，同样加入对细胞毒性低于20%的药物浓度，经过重复实验，a2b2组合中药物作用效果显著，a1b1组合中不明显，表明转染率高低影响药物作用效果，进一步确定a2b2组合为优化质粒配比，即：pCDNA3.1(+)-Tat与LTR-Luc分别以0.017，0.001 7 μg/ml配比转染Hela细胞可以获得较高的Tat蛋白表达，且待测药物对其抑制作用灵敏，尤其阳性对照DRB表现出较为显著的抑制率。表2  pCDNA3.1(+)-Tat与LTR-Luc梯度稀释配比转染HeLa细胞所得RLU值（略）
       表中a 表示质粒pCDNA3.1(+)-Tat ，其中a1为原液；a2为3倍稀释液；a3为9倍稀释液；a4为27倍稀释液；a5为0； b 表示 LTR-luc，其中b1为原液，b2为10倍稀释液，b3为30倍稀释液
       2.2.3  转染时培养液中小牛血清（NCS）的含量对药物抑制作用的影响细胞转染过程中通常不加NCS，为使该模型能表现出较高的稳定性、重现性、敏感性，本实验对NCS的含量进行了试验，分别为不加NCS及NCS在培养基中占5%，10%3种情况，结果如表3及图3所示。
       从表3及图3可看出，随着转染过程中NCS含量的升高，细胞转染率显著降低，当NCS含量为5%时，药物抑制率较为明显，故确定NCS用量为5%。
       2.2.4  转染后细胞接种到24孔板的浓度对药物抑制作用的影响 确定了两种转染质粒的配比及转染过程中NCS含量关系，将24孔板转染转换为200 ml的细胞培养瓶直接转染后分传到24孔板，可简化操作，减少影响因素，适宜大批量药物筛选。培养瓶中以6×105cells/ml 浓度传代，6 ml/瓶，转染率与24孔板直接转染效果相当，略偏高，转染细胞均匀地传入24孔板后密度为3.5×105cells/ml，加药后细胞生长快，孵育15 h 培养基变黄，细胞长满24孔板，药物抑制率不明显或重现性差，故将转染前细胞密度降低为3×105cells/ml，并对转染后细胞分传入24孔板的浓度进行了梯度实验，结果如表4及图4所示。表3   转染过程中小牛血清（NCS）的含量对药物抑制作用的影响（略）
       表4和图4所得结果显示：随着24孔板中细胞密度的减小，RLU值减小，药物抑制作用无明显变化。其中4倍、8倍稀释液RLU值较低，结果可信度小；不稀释或2倍稀释下RLU值较高，药物作用一致。故转染细胞可平均分传入两块24孔板，进行大批量药物筛选。表4  转染细胞分传密度对药物抑制作用的影响（略）
       2.2.5  药物作用时间的影响对药物作用时间进行试验：12，24，48，60 h后分别检测结果，表明药物作用24～48 h检测结果较佳，作用40 h后，细胞约为90%，此时收集细胞检测结果最佳。
       2.2.6  转染前细胞状态的影响转染前细胞状态好，转染率高，药物抑制率偏低；细胞状态正常，则药物抑制率重现性强。细胞状态差，转染率略低，药物抑制率重现性差；细胞状态较差，转染过程中细胞生长慢，加药后细胞收缩变小，但不凋落，结果检测时，RLU值仍在1 000～9 000，药物作用可信度低。故在进行转染前有必要调节细胞生长状态。
       2.2.7  药物浓度的影响采用以上确定的最佳因素，对阳性对照DRB进行了浓度梯度抑制作用实验，如表5及图5所示。
       表5及图5表明：随着DRB浓度的降低，RLU值降低，即：DRB对Tat蛋白的抑制作用降低，DRB的抑制作用与其剂量呈依赖性关系；进一步说明本模型构建成功，稳定性好、重现性强。另外，DRB对细胞毒性较大，在大于50 μmol/ml时，细胞部分死亡，随着其浓度的增加，细胞死亡数量增多。
       3  讨论
       艾滋病药物筛选暂无理想的动物模型，目前主要从细胞和分子水平上进行体外筛选［8］。王岱等［7］首次应用牛免疫缺陷病毒(BIV) 合胞体和BlV 长末端重复序列(LTR) 引导的荧光素酶(Luc) 基因，建立抗AIDS药物的筛选和评价模型。随着基因工程、生物化学和分子生物学及检测仪器的发展，该模型原理、机理方面得以深入研究，由HIV 取代BIV［9～12］，但对其建立方法等仅作简要介绍。本研究首次对该模型的实验室构建、模型优化等进行了全面、系统的研究，进一步完善了该模型，为抗HIV药物筛选积累资料。表5  药物浓度的影响实验（略）
       经过优化建立的细胞模型，其结果表明：①目的基因与报告基因的配比起决定性作用，当两者含量过高时，Tat表达量大，药物几乎无抑制作用，以0.017，0.0017 μg/ml配比可以获得较高的Tat蛋白表达及显著的药物抑制作用；②以3×105细胞/ml，6 ml/瓶，转染后细胞分传入24孔板的浓度对药物抑制作用有一定的影响，但不起主要作用，一瓶可分传两块板；③转染前细胞状态对药物敏感性有一定影响，故转染前调节细胞生长状态，尽量使细胞生长均匀、形态正常。④转染过程中小牛血清含量越低，转染率越高，当含量为5%时，转染率高且药物敏感性显著；⑤药物作用40 h 后检测结果较佳。
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