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       【摘要】 
       目的研究板蓝根中3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮的抗内毒素作用。方法将3（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮配成0.5%水溶液，鲎试验法进行抗内毒素定量测定；内毒素致家兔发热实验检测3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮体内抗内毒素作用；脂多糖致小鼠死亡实验测定3－（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮保护作用及3（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮对脂多糖致小鼠过度释放肿瘤坏死因子和一氧化氮（NO）的影响实验，研究板蓝根中3－（2"－羧基苯基）1（3H）-喹唑酮的抗内毒素作用。结果0.832 mg·ml-13（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮可使4EU内毒素降解为1.22EU，破坏率为70.56%；0.5%3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮溶液可使内毒素引起的家兔体温升高显著降低、使同等剂量脂多糖引起的小鼠死亡率从70%降为25%；板蓝根中的3（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮可抑制脂多糖致小鼠血清中TNFα和NO的过度释放，其抑制率呈剂量依赖性。结论 从板蓝根中提取分离出的3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮有抗内毒素作用。
       【关键词】  板蓝根 3 （2"羧基苯基） 1（3H） 喹唑酮 内毒素 脂多糖
       Anti-Endotoxic Effects of 3(2"carboxyphenyl)4(3H)quinazolinone from Radix Isatidis
       WANG Xifen,LIU Yunhai
       1.Gongyi People"s Hospital, Gongyi, Henan, 451200, China;
       2.The Affiliated Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan，Hubei 430030，China
       Abstract：ObjectiveTo study the antiendotoxic effect of 3(2"carboxyphenyl)4(3H)quinazolinone (CPQZN) isolated from Radix Isatidis . MethodsCPQZN was extracted and isolated from Radix Isatidis and diluted into 0.5% solution. The content of endotoxin pretreated with CPQZN was quantitatively determined using Limulus test. The inhibition of endotoxin -induced fever by CPQZN was measured in rabbits. The Lipopolysaccharide( LPS)induced death in mice pretreated with and without CPQZN was compared. Influence on the LPSinduced release of TNFα and NO in macrophages from mice was studied.ResultsAfter pretreatment with CPQZN , 70.56% of endotoxin was destroyed, the endotoxin-induced fever in rabbits decreased significantly ;  the rate of LPS-induced death in mice dropped from 70% to 25%; the release of TNFα and NO induced by LPS in mice could be inhibited by CPQZN from Radix Isatidis and the percentage of inhibition was dependent on the dosage.ConclusionCPQZN isolated from Radix Isatidis has anti-endotoxic effect.
       Key words：Radix Isatidis;   3-(2"-carboxyphenyl)-4(3H)-quinazolinone (CPQZN);   Endotoxin;   Lipopolysaccharide (LPS)
       细菌内毒素(Endotoxin)是迄今发现的生物活性最为广泛的物质之一。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是内毒素毒性核心，在众多多发常见病的发生、发展和加重中起关键作用。内毒素拮抗剂的研究已成为生命科学的热门课题。
       现代医学研究认为，中药材清热解毒之功效主要集中于其抗细菌内毒素和抗病原微生物作用。板蓝根是传统的清热解毒中药，自发现其抗内毒素作用以来，已对其进行了大量研究［1，2］ 。中药化学成分是中药药理作用的物质基础［3］，板蓝根化学成分抗内毒素作用已有报道［4～6］，但仅用体外鲎试验法影响因素多，我们对从板蓝根中提取得到的3－（2"－羧基苯基）－1（3H）-喹唑酮的抗内毒素作用进行了系统研究，并从分子水平探讨其抗内毒素作用机制。
       1  器材
       1.1  3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮提取和分离 
       板蓝根产于河北邢台，经华中科技大学同济医学院药学院张长弓教授鉴定为十字花科菘蓝Lsatis indigotica Fort．的干燥根。将其粉碎成细粉，用95%乙醇浸泡72 h，继用乙醇渗漉，渗漉液回收乙醇至无醇味并浓缩至浸膏状，用石油醚反复萃取，除尽石油醚部位，继用氯仿反复萃取得氯仿部位；再采用硅胶柱层析，用不同比例氯仿甲醇液作梯度洗脱，得到抗内毒素活性部位最强的F022部位。为了得到抗内毒素活性物质，用同样的方法将F022 进行系统的化学成分研究共得到14个化合物，其中F02212，得率0.138%，经中国科学院上海药物研究所鉴定为3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮［（3(2"carboxyphenyl)4(3H)quinazolinone (CPQZN)］，且为自然界中首次分离得到。
       1.2  3（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮溶液配制   
       取3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮0.5 g，加热纯化水溶解并稀释至100 ml，用NaOH溶液调pH 6～7，灭菌消毒备用。
       1.3 试剂 
       脂多糖(LPS，E ColiO26B6，5 mg /支，批号11K4040，Sigma公司)；内毒素工作标准品(E .ColiO111B4，120 EU/支，批号20004，中国药品生物制品检定所)；鲎试剂(TAL，0．1 ml /Amp，灵敏度0.05 EU ·ml-1 ，批号0008152)和细菌内毒素溶解水(内毒素限量0.015 EU·ml-1，批号000308)，均购自湛江安度斯生物制品有限公司；卡介苗(BCG，50 mg/Amp ，批号990901，上海生物制品研究所)；TNFα试剂盒(北京邦定泰克生物有限公司)；N-1一萘乙二胺盐酸盐(分析纯，天津化学试剂研究所)；NaNO2(德国，湖北大学化工厂分装)；对氨基苯磺胺(分析纯，北京芳草医药化工研究公司)。
       1.4  动物 
       日本大耳白家兔，体重2.0～2.5 kg，雌雄兼用；昆明种小鼠，体重16～18 g，雌性，均由华中科技大学同济医学院医学实验动物中心提供。
       1.5 仪器 
       EDS98型细菌内毒素检测仪，购自北京金山川科技发展有限公司；MK3型酶联免疫检测仪(Labsystern Dragon公司)；181 5TC型培养箱(Shel-I ab公司)；XW 型旋涡混合器由上海医科大学研究所提供。
       2  方法
       2.1  3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮破坏内毒素定量测定
       2.1.1  内毒素液配制 
       取内毒素工作标准品（120 EU·Amp-1）加入1 ml细菌内毒素溶解水，于旋涡混合器振荡30 s，配制成120 EU·ml-1内毒素液。
       2.1.2  标准曲线制备
       分别取内毒素适量，用细菌内毒素溶解水稀释成5.0，2.5，1.0，0.5，0.25和0.1 EU·ml-1系列内毒素浓度（C），各取0.2 ml加入鲎试剂中（双管法），旋涡混合器振荡后迅速插入内毒素定量测定仪，记录凝胶形成时间（Tg），用logTg对logC作图，得标准曲线logTg = 2.800 49 - 0.233 26 logC，r = -0.990 5，内毒素在0.1～5.0 EU·ml-1浓度范围内与凝胶形成时间呈线性关系，最低检出为0.015 EU·ml-1.
       2.1.3  回收率
        
       按上述方法，取鲎试剂5支，分别精密加入浓度为4 EU·ml-1内毒素液0.2 ml，测定凝胶形成时间，按标准曲线计算浓度为（4.218±0.243）EU·ml-1，回收率为（105.45±10.52）%。
       2.1.4  样品测定 
       取0.5 ml 3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮液（0.5%）与0.1 ml内毒素液混合，于水浴（37±1）℃温育（60±2） min，温育后取0.1 ml溶液加入0.4 ml细菌内毒素溶解水，使3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮和内毒素终浓度分别为0.832 mg·ml-1和4 EU·ml-1，此为样品组，同时用0.832 mg·ml-13（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮和4 EU·ml-1内毒素液分别作阴性和阳性对照组，测定内毒素浓度。3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对内毒素的破坏率（r）按下列公式［7］计算：
       r （%）=1-（样品组-阴性对照组）阳性对照组-阴性对照组×100%
       2.2  3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对脂多糖致家兔发热的影响
       2.2.1  内毒素液配制 
       将内毒素工作标准品用0.9%氯化钠注射液6 ml溶解，使成20 EU·ml-1内毒素液。
       2.2.2  动物实验 
       实验前1周将家兔于实验室饲养；实验前3 d，每天测肛温2次，使家兔适应操作环境；实验前1 d下午开始家兔禁食不禁水；实验时，隔30 min测肛温1次。选肛温在正常范围内且肛温差≤0.2℃的家兔15只，随机分为3组，每组5只。样品组和阴性对照组分别按5 ml·kg-1自耳缘静脉注射0.5% 3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮液，内毒素模型组注入等量0.9%氯化钠注射液，10 min后，样品组和内毒素模型组按同法注入2 ml·kg-1内毒素液，注射后30 min开始，每隔30 min测肛温1次，按《中国药典》“热原检查法”规定［8］，共测8次。
       2.3  3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对脂多糖致小鼠死亡的保护作用
       2.3.1  卡介苗敏化小鼠 
       将卡介苗（50 mg·Amp-1）加0.9%氯化钠注射液溶解成5 ml，按文献方法［9］，小鼠ip 200 mg·kg-1，按常规方法饲养，第10天开始实验。
       2.3.2  脂多糖液配制
       取脂多糖1支，加0.9%氯化钠注射液溶解成25 ml，得浓度为0.2 mg·ml-1脂多糖溶液。
       2.3.3   动物实验 
       实验前16 h小鼠禁食不禁水，实验时将小鼠随机分为3组，每组20只；样品组和空白对照组按ip 20 ml·kg-13（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮液，脂多糖模型组按同样量注射0.9%氯化钠注射液，1.5 h后，重复给药1次，于第2次给药后0.5 h，样品组和内毒素模型组自尾静脉注射0.2 ml/20 g鼠脂多糖液，于72 h内观察小鼠死亡情况。
       2.4   3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对LPS致小鼠血清中TNFα和NO过度释放的影响
       2.4.1  样品液的制备 
       取0.5%的3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮液用内毒素溶解水分别稀释成0.25%，0.125%的溶液。
       2.4.2   脂多糖溶液的制备 
       取脂多糖1支（5mg）用内毒素溶解水溶解并稀释成10 ml（500 μg·ml-1），振荡混合30s。再取0.8 ml用内毒素溶解水稀释到100 ml（4μg·ml-1）。
       2.4.3   血清样品制备 
       取30只小鼠，每只ip BCG 0.2 ml，按常规饲养10 d，实验前14 h禁食不禁水。实验时，将小鼠随机分为5组，每组6只。药物组分别ig给予0.5%，0.25%，0.125%样品液0.4 ml，正常组和模型组给生理氯化钠液。ig后0.5 h，药物组和模型组每只小鼠分别尾静脉注射 LPS 0.2 ml·（20 g）-1， 9 h后，乙醚麻醉，眼眶内取血，取血清于-20℃贮存备用。
       2.4.4  TNFα检测 
       用ELISA法，按试剂盒说明书操作要求进行，在抗人细胞因子单抗包被的酶标板上加入系列浓度标准品溶液及100 μl待测鼠血清样品，同时设空白对照(双管法)，37℃孵育60 min后加入TMB底物液显色15 min，于450 nm波长处测吸光度(A)值，绘制标准曲线，结果在10～1 000 pg·ml-1范围内呈线性关系。各血清样品按同法测定，并按标准曲线计算TNFα浓度。
       2.4.5  NO含量测定
       用Griess试剂法,精密称取NaNO2 1 g于100 ml容量瓶中，加水溶解(10 mg·ml-1)；再精密量取1 ml，加水至100 ml(100 μg·ml-1)；再分别取适量稀释得到系列溶液；各取50 μl，分别加Griess液(含1%对氨基苯磺胺、0.1%N-1萘乙二胺盐酸盐、2.5%磷酸)50 μl，室温放置10 min，于酶联免疫测定仪上550 nm处测定各孔A值，绘制标准曲线，结果在1～100 μg·ml-1范围内呈线性关系。另取鼠血清样品50 μl加入等体积Griess液，同法检测，由标准曲线计算NO浓度。
       3  结果
       3.1  3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对内毒素的破坏作用
       样品管、阳性对照管和阴性对照管内毒素平均浓度分别为1.22，4.036和0.045EU·ml-1，r=［1-(1.22-0.045)/(4.036-0.045)］×100% = 70.56%。浓度为0.832 mg·ml-1的水杨酸液对4EU·ml-1内毒素液的破坏率为70.56%。
       3.2  3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对内毒素致家兔发热的影响
       按每只家兔给药后的最大升温数与给药前平均基础体温之差求每组家兔平均最大升温DTmax，另按每只家兔给药后4 h内体温随时间变化求体温反应指数TRI4（4 h内家兔体温变化曲线下面积）。结果显示，家兔给予内毒素（40EU·kg-1）可引起典型发热反应，而给予0.5%3（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮溶液（5 ml·kg-1）后再给予等量内毒素液，则TRI4和DTmax均降低，而样品组与3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮液组引起家兔发热差异无显著性。结果见表1。表1  3（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮对内毒素致家兔发热的影响(略)
       3.3   3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对小鼠死亡的影响
       样品组（20只）10 h后死亡5只，死亡率25%；脂多糖模型组（20只）5 h内死亡14只，死亡率70%；（2"－羧基苯基）1（3H）喹唑酮组(20只)72 h内全部存活。样品组与脂多糖模型组比，存活率差异有显著性（P＜0.05）。
       3.4   3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对LPS致小鼠血清中TNFα和NO过度释放的抑制作用
       小鼠经3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮不同浓度处理后再给予同等剂量LPS，其血清中TNFα和NO浓度及抑制百分率见表2，抑制百分率按上述公式计算。表2  3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对LPS致小鼠血清中TNFα和NO过度释放的抑制作用(略)
       经t检验，与模型组比较*P<0.05, **P<0.01；n=6
       
       由表2可见，3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对LPS刺激小鼠体内释放TNFα和NO有抑制作用，其抑制率0.125%～0.5%浓度范围内呈剂量依赖性。
       4  讨论
       国内板蓝根颗粒有900多个批准文号，目前800多个厂家生产，用量之大，堪称中成药之最。中药化学成分是中药药理作用的物质基础,探讨板蓝根清热解毒的物质基础是中药现代化的必然途径，该研究发现从中药板蓝根中提取得到的3（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮于体内、体外均有抗内毒素作用，且含量高，抗内毒素作用强，可以作为指标成分，用于板蓝根药材生产、制剂工艺及产品的质量控制。
       动态显色凝胶法操作简便，灵敏度高，测定范围广，通常内毒素浓度在0.05～300 EU·ml-1浓度范围内均可作定量测定。本实验经3（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮液0.832 mg·ml-1作用后，内毒素浓度由4 EU·ml-1降为1.22 EU·ml-1，破坏率达70.56%。
       致热是内毒素的主要特性之一，家兔对内毒素最敏感，故常被用于清热解毒药研究。关于引起家兔发热的剂量，各家报道不一致。我们发现内毒素模型组给予40 EU·kg-1 E. Coli O111B4可产生典型发热反应，以25 mg·kg-13（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮解兔热与只给3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮液相比差异显著。
       不同种类实验动物对脂多糖敏感性不同。文献报道，小鼠脂多糖半数致死量为25 mg·kg-1［9］，经用卡介苗增敏，0.2 ml/20 g鼠（2 mg·kg-1）脂多糖可致70%小鼠死亡，40 μg·kg-1（800 ng/20鼠）可致小鼠巨噬细胞过度释放TNFα和NO等炎性细胞因子。因卡介苗能刺激T细胞活化吞噬细胞，减少脂多糖用量。我们以100 mg·kg-1  3（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮拮抗内毒素致小鼠死亡是安全的。实验发现，给脂多糖前给3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮，对小鼠死亡有保护作用，而在给脂多糖后给3（2"羧基苯基）1（3H）-喹唑酮，则效果差。可见在免疫系统激活前给予3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮，有助于抗内毒素作用发挥。
       体内TNFα和NO等炎性细胞因子的过度释放在内毒素感染性休克发病过程中的作用正在得到越来越多的证实，抗TNFα的一些防治措施将成为内毒素感染性休克防治的重要途径。体内大量NO释放是导致内毒素休克、低血压及多脏器功能衰竭的主要因素之一。NO的大量释放可通过与超氧阴离子结合成氧化亚硝基阴离子而对器官组织造成损伤。在内毒素引起的休克和多脏器功能衰竭中，阻止NO大量释放可防止其造成低血压及减轻其导致的组织氧化性损伤。3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮对LPS致鼠巨噬细胞过度释放TNFα和NO有抑制作用，可见板蓝根通过抑制炎性细胞因子发挥清热解毒功效。本实验从分子水平阐述了从板蓝根中提取得到的3（2"羧基苯基）1（3H）喹唑酮的抗内毒素作用机制。
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