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       【摘要】 
       目的利用超临界CO2流体法从红豆杉中提取分离紫杉醇。方法用高效液相色谱法（HPLC）测定萃取物中紫杉醇含量。结果粒径为0.25～0.45 mm的红豆杉枝叶在27.6 MPa,31℃下,以甲醇为夹带剂和吸收液进行萃取时,在120 min内可使紫杉醇萃取完全,萃取率达96.5%。结论与传统的乙醇3次提取方法相比，超临界流体萃取法流程简单，步骤少，耗时短，提取率高，无废渣溶剂残留，是一种较好的提取方法。
       【关键词】  超临界CO2萃取 紫杉醇 红豆杉
       Supercritical-CO2 Fluid Extraction of Taxol from Branches and Needles of Taxus Xinfen Jiangxiensis
       LI Qingsong， LI Yinbao， YU Lei， PENG Xiangjun
       (Department of Pharmacology, Gannan Medical College, Ganzhou, Jiangxi,341000, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the supercritical-CO2 fluid extraction of taxol from branches and needles of Taxus.MethodsA HPLC method was developed for the determination of taxol content in the extracts.ResultsTaxol could be extracted from branches and needles of Taxus which was grinded to powder at 0.25～0.45mm in diameter at 27.6KPa and 31℃ when methanol was used as entertainer and absorption liquid. ConclusionCompared with traditional solvent extraction method with alcohol, supereritical-CO2 fluid extraction can improve extraction yield of taxol and protect natural environment because of its less wasted solvent and short time.
       Key words：Supercritical-CO2 ；  Fluid extraction;  Taxol
       20世纪60年代发现的紫杉醇（Taxol）是一种含于短叶红豆杉树皮中的具有抗癌活性的二萜类化合物，对卵巢癌、乳腺癌等具有较好的效果，是最近20年较为热点的抗癌药物之一［1］。红豆杉树种生长缓慢，也是稀有保护植物。紫杉醇主要含于树皮中，其余部位的含量极低［2］，故合理有效地利用其自然资源十分必要。本实验采用超临界CO2萃取（CO2-SFE）装置，对信丰金盆山红豆杉枝叶中紫杉醇的萃取进行研究。由于紫杉醇分子量较大，单独采用CO2-SFE难以达到预期效果，且压力太高，给大规模培养带来更大的困难，因此本实验采用加夹带剂，用优选法对CO2-SFE的工艺条件进行优化，所得提取液用HPLC法测定其紫杉醇含量，取得了较好的效果。
       1  材料
       CO2-SFE装置（南通市成宇石油科技开发有限公司）萃取器容积为1 000 ml，操作压力可达50 MPa，第一和第二分离器均为500 ml，操作压力可达10 MPa，萃取器和第一分离器均有保温装置，操作温度可达90℃。HPLC：为日本岛津LC-6A型高效液相色谱仪；红豆杉枝叶：由信丰金盆山林场红豆杉种植基地提供；紫杉醇对照品：由华西药学院研究所提供；CO2气体：食品级，纯度为99.5%；其余试剂为分析纯。
       2  方法
       提取液均用HPLC测定紫杉醇含量。
       2.1  CO2-SFE法萃取紫杉醇取300.1687 g粒径为0.25～0.45 mm的枝叶样品在27.6 MPa，31℃进行超临界CO2流体萃取，因为超临界CO2流体对极性强的物质溶解能力较差，加入少量的甲醇作为夹带剂，可大大增加其溶解能力。
       将样品放入萃取池中，CO2和甲醇分别由CO2泵和夹带剂泵打入各泵的腔体中，经流体混合后，流入萃取器中的集流腔，达到27.6 MPa，31℃后进入萃取池开始萃取，动态萃取时，超临界流体经限流器流入收集瓶后减压排放，流体带出的物质溶于收集液中予以收集，用甲醇作吸收液，在30，60，90，120 min各收集1次，收集液经旋转蒸发浓缩，并于50℃真空干燥2h后检测其中的紫杉醇含量。
       2.2  紫杉醇含量测定
       2.2.1  色谱条件色谱柱：贝克曼ODS（10 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈-甲醇（30∶70）；检测波长：227 nm；流速：1.0 ml/min。
       2.2.2  线性关系精密称取紫杉醇约25 mg，加醇至250 ml，分别量取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml；分别加入流动相，定量至25 ml，取10 μl进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程为Y=-973.6+287.1X，r=0.999，表明紫杉醇在10～25μg/ml，浓度内峰面积与浓度呈良好的线性关系。
       2.2.3  回收率实验准确称取紫杉醇对照品10 mg，于100 ml容量瓶中加入溶剂，定量过滤，滤液摇匀，得到对照储备溶液。精密量取3 ml置于25 ml容量瓶中，加入流动相稀释至刻度定容，进样10 μl。计算平均回收收率为99.98%，RSD=0.97%（n=6）。
       2.2.4  稳定性实验将上步溶液陈化6 h，重复进行，峰面积基本不变，避光放置24 h，峰面积基本不变。
       2.2.5  含量测定分别精密称取紫杉醇对照品自制试样，10 mg加入流动相溶解并制成2 μg/ml，按上述方法测得谱图，由归一化方程计算出含量为64.48%。
       2.2.6  杂质的处理实验对比参照样制备：准确称取紫杉醇对照品10 mg。已知杂质对照品10 mg，置于50 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取5 ml置100 ml容量瓶中，加流动相并稀释至刻度。
       自制样品制备：准确称取自制样5 mg置于250 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度。
       取对照样品和自制样品各10 μl进样，记录色谱图对自制样品出现的已知杂质，按外标法计算含量，对于自制样品出现的未知杂质，则与对照品溶液中紫杉醇峰比较计算，最后计算出杂质含量。
       3  结果
       利用超临界CO2流体萃取法从红豆杉枝叶中提取分离紫杉醇，用高效液相色谱法测定萃取物中紫杉醇含量，其结果表明，粒径为0.25～0.45 mm的红豆杉枝叶在27.6 MPa，31℃下以甲醇为夹带剂和吸收液进行萃取，在2 h内可使紫杉醇萃取完全，萃取率达96.5%，萃取物中紫杉醇纯度可达1%，以贝克曼ODS4.6 mm×250 mm为色谱柱，乙腈—甲醇为流动物，流速1.0 ml/min，紫杉醇在10～25 μg/ml范围内线形良好，平均回收率为99.98%，RSD=0.97%。
       4  讨论
       本文仅对CO2—SFE萃取紫杉醇作为初步探索，要开发产品生产，还需对CO2的用量，萃取温度，夹带剂的浓度及夹带剂的用量等最佳条件作进一步研究。
       紫杉醇粒径为0.25～0.45 mm时，流动相选择乙腈-甲醇（30∶70）分离效果最好，峰形对称；波长在225 nm～229 nm处均可得到有效波形，本实验选择实际测量结果的平均值，即227 nm，此波长下检测效果最为明显。由于紫杉醇本身具有邻位两个环内双键，具有一定的化学活性，因此检测样不能长期保存，避免与氧化剂接触。
       【参考文献】
         　　［1］Wani M C,Taylor H L,Wall M E,et al. Plant antitumor agents the isolation and structure of Taxol ,a novel antileukemic and antirumor agent from taxus brevifolia［J］.J Am Chem Soc,1971,93:2325.
       
       ［2］史清文,赵 丁,刘素云，等.天然药物紫杉醇的研究概况与开发综述［J］.天然产物研究与开发,1997,9(3):102.