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       【摘要】 
       目的研究大果山楂黄酮提取物对大鼠实验性慢性肝损伤、肝纤维化的预防作用，并探讨其作用机制。方法采用40％ CCl4皮下注射制备肝纤维化大鼠模型，分别用3种不同浓度的大果山楂黄酮提取物进行干预，观察检测大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清白蛋白与血清球蛋白的比值、肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量以及肝组织病理学变化。结果大果山楂黄酮提取物预防给药能降低CCl4所致大鼠血清中异常增高的ALT，AST； 升高CCl4所致大鼠血清中异常降低的A/G比值；大果山楂黄酮提取物预防给药能使肝损伤大鼠肝匀浆异常降低的SOD含量上升，异常增高的MDA含量下降；光镜下观察肝纤维化模型组大鼠肝细胞严重变性、坏死，胶原纤维明显增加，大果山楂黄酮提取物预防各组大鼠肝细胞病理损伤得到明显改善。结论大果山楂黄酮提取物对大鼠实验性肝损伤具有一定程度的预防作用和抗肝纤维化作用。
       【关键词】  大果山楂黄酮提取物 肝纤维化 谷丙转氨酶 谷草转氨酶 白蛋白 球蛋白 超氧化物歧化酶 丙二醛
       Experimental Study of the Malus doumeri(Bois)Chev. Flavonoids Extraction  on Chronic Hepatic Injury Induced by CCl4 in Rats
       PAN Ying, ZHANG Linli
       People"s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region , Nanning,530021,Guangxi,China
       Abstract:ObjectiveTo study the anti-hepatofibrotic effect of the  Malus doumeri(Bois)Chev. flavonoids extraction  on experimental hepatic fibrosis and its mechanism.MethodsThe hepatic fibrosis rat model was developed by subcutaneous injection of 40％CCl4 (5 ml/kg) and rats were treated with extract of Mdf at 1.5g/（kg·d）, 0.75/（kg·d） or 0.38/（kg·d）. Alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),Albumin(A),globulin(G)levels were measured and pathological changes after of liver tissue was examined HE staining.ResultsThe extract of Mdf  could reduce the serums  levels of ALT and AST, increase the hepatic ratio of A/G,increase the activity of superoxide dismutase and reduce  the level malondialdehyde Examined by light microscope，the degeneration and necrosis level of hepatocytes and the distribution of collagen fibrosis were markedly increased in the model group. The extract of Molf could significantly alleviate pathological changes and the collagen fibrosis.ConclusionThe extract of Mdf can protect hepatocytes from injury and prevent the progression of hepatic fibrosis in rats.
       Key words:Malus doumeri(Bois)Chev. flavonoids extraction;  Hepatic fibrosis;  Alanine Aminotransferase;  Aspartate Aminotransferase;  Albumin;  Globulin；  Superoxide dismutase；  Malondialdehyde
       
       大果山楂为蔷薇科青苹果属台湾林檎的干燥成熟果实,  性味甘、酸、涩、微温,有理气健脾、消食导滞之功效,在广西作为山楂习用已有八十多年的历史,已知其化学成分有维生素、鞣质、萜类、苷类、黄酮类、酚类和微量元素,其中黄酮含量丰富,是中药山楂的2倍多［1］。已知某些黄酮类成分具有很好的保肝作用,因此本文从保肝的角度，研究了大果山楂黄酮提取物对大鼠实验性慢性肝损伤、肝纤维化的预防作用，观察了大果山楂黄酮提取物对CCl4诱发大鼠实验性慢性肝损伤、肝纤维化的影响。现报道如下。
       1  器材与方法
       1.1  动物
       Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重(180±20) g,由广西中医学院动物实验中心提供,桂医动字第11004号。
       1.2  试剂与药品
       大果山楂Malus domeri(Bois)Chev.,购自广西贺州，经广西区药品检验所黄燮才专家鉴定为蔷薇科苹果属植物台湾林檎的干燥成熟果实；大果山楂总黄酮提取物，自行提取。四氯化碳(CCl4)淮南化学试剂。临用前以花生油调和按体积比配成40％ CCl4溶液。秋水仙碱，由云南西双版纳制药厂生产，批准文号：国药准字H53021369。将秋水仙碱片研碎用蒸馏水配成0.02 mg/ml混悬液，用作阳性对照药物。ALT试剂盒、AST试剂盒、白蛋白试剂盒、总蛋白试剂盒，伊利康生物技术有限公司生产,批号分别为060305，060407，060503，060517。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测试盒,南京建成生物工程研究所产品,批号20060701。
       1.3  仪器
       JY9222D超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所);UV22100分光光度计(日本岛津);电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂生产)。
       1.4  方法
       ［2］Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重(180±20) g，随机分为6组：空白对照组(10只) ，肝纤维化模型对照组(10只)，秋水仙碱阳性对照组(10只)，大果山楂总黄酮提取物预防低、中、高剂量组各10只。普食普水饲养1周后开始造模，除空白对照组外其余各组以40％ CCl4花生油溶液腹部皮下注射，首次  5 ml/kg，以后3 ml/kg，2次/周，连续注射8周。造模前两天开始灌胃给药或蒸馏水，一直持续到实验结束，1次/d，剂量为：空白组和模型组灌以蒸馏水10 ml/(kg·d)；秋水仙组灌以秋水仙碱0.2 g/(kg·d)；大果山楂总黄酮提取物预防低、中、高剂量组分别灌以大果山楂总黄酮提取物1.5,0.75, 0.38 g/(kg·d)，逐日观察大鼠活动、进食量、毛色等情况。8周末各组大鼠于末次灌胃24 h后取材、处死。每只大鼠摘眼球法取血约3 ml，装入预先滴有肝素50 μl的EP管中，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，赖氏法测定血清ALT，AST，测SOD，MDA。取血完毕后处死大鼠，立刻剖开腹腔，暴露肝脏，取肝右中央叶约0.5 cm3，迅速投入10％福尔马林溶液中固定。石蜡包埋，制备病理切片，HE染色，光学显微镜观察肝组织病理变化。肝组织病理学改变分为4级：正常肝组织为“－”；肝小叶结构完整，肝细胞点状坏死，炎细胞浸润，散在的肝细胞脂肪变性为“＋”；纤维组织增生向肝组织小叶内延伸“＋＋”；肝细胞结构紊乱，纤维组织增生，桥接坏死，早期肝坏死为“＋＋＋”［3］。
       1.5  统计学方法
       所有实验数据使用SPSS11.5计算机软件进行统计分析，计数资料比较用Ridit检验，计量资料比较用t"检验。
       2  结果
       2.1  大鼠一般情况在实验过程中，空白组大鼠体重自然增加，行动敏捷，食欲正常，皮毛密集而有光泽；模型组大鼠精神萎靡，倦卧少动，或易激惹，皮毛干涩，蓬松少华，食欲欠佳，体重增长缓慢或不增长，尤以雌性大鼠明显，大果山楂总黄酮提取物用药预防各组精神、毛色及进食量均好于模型组。
       2.2  大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和白蛋白与球蛋白比值的变化模型组大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的含量均有明显升高，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.001)。大果山楂总黄酮提取物预防组的低、中、高剂量组血清ALT，AST含量均低于模型组，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01和P<0.001)。模型组大鼠血清白蛋白与球蛋白比值明显降低，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.001)，大果山楂总黄酮提取物预防组的低、中、高剂量组血清白蛋白与球蛋白比值均高于模型组，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05和P<0.01)。结果见表1。表1  大果山楂提取物对实验大鼠肝功能的影响(略 )
       2.3  大鼠肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量模型组大鼠肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)含量显著降低，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.001)，大果山楂总黄酮提取物预防组的低、中、高剂量组大鼠肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)含量均高于模型组，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01和P<0.05)；模型组大鼠肝组织匀浆丙二醛(MDA)含量显著升高，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.001)，大果山楂总黄酮提取物预防组的低、中、高剂量组大鼠肝组织匀浆丙二醛(MDA)含量含量均低于模型组，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01和P<0.001)。结果见表2。表2  大果山楂提取物对实验大鼠肝匀浆SOD及MDA 的影响(略 )
       2.4  大鼠慢性肝损伤肝脏组织病理情况结果见表3。
       2.5  大鼠肝脏病理变化空白组肝小叶结构完整，肝细胞无变性、坏死、炎性细胞浸润及纤维增生。模型组多数肝小叶正常结构被破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性坏死明显，表现为脂肪变性和细胞水肿，伴有程度不等、范围不一的肝细胞坏死及炎性细胞浸润，汇管区扩大，有粗细不均的纤维束从汇管区伸出，纤维组织增生，提示造模成功。秋水仙碱组可见程度不等、范围不一的肝细胞坏死区及变性的肝细胞，以脂肪变性为主，可见少量正常肝细胞。提示秋水仙碱有预防肝纤维化的作用。大果山楂总黄酮提取物各剂量组肝细胞结构基本正常，纤维组织增生明显减轻，脂肪变性，炎性细胞浸润减少。结果见表3。表3  大果山楂提取物对实验大鼠肝脏病理分级的影响
       （略）
       3  讨论
       CCl4是制作肝损伤动物模型的常用药物,通过肝微粒体中的细胞色素P450代谢激活后生成的自由基具有很强的诱导肝脏脂质过氧化的作用［2］，最终导致生物膜破坏，肝细胞坏死。由于肝细胞坏死，细胞膜通透性增加，ALT，  AST大量渗入血液，而使血中酶活性增高。所以血清中这两种转氨酶活性的增高在一定程度上反映了肝细胞损害和坏死的程度。
       慢性肝损伤主要表现为血清白蛋白下降，球蛋白增加，白蛋白与球蛋白的比例倒置；血清ALB，GIB及A/G与肝组织病理分级及纤维化分期均有相关性［4］。
       SOD是细胞内天然的氧自由基清除剂,而MDA则是氧自由基与细胞膜表面不饱和脂肪酸反应(脂质过氧化反应)的产物；大鼠腹腔注射CCl4导致慢性肝损伤时，过量的氧自由基产生于肝组织细胞并对其发生损伤时，会引起SOD水平下降，MDA含量升高［3］。慢性肝损伤时，氧化应激,特别是脂质过氧化，细胞因子的生成导致肝星形细胞活化和增殖，活化的肝星形细胞合成分泌大量以胶原蛋白为主的细胞外基质在肝内沉积，引起肝脏纤维化。
       在本实验研究中，大果山楂总黄酮提取物预防用药可以有效地保护CCl4给药后大鼠肝脏细胞，使肝脏细胞损伤程度降低，表现为给予CCl4和大果山楂总黄酮提取物的各组大鼠血清ALT，AST水平低于模型组，血清白蛋白与血清球蛋白的比值高于模型组；纤维组织增生、脂肪变性、炎性细胞浸润低于模型组说明大果山楂总黄酮提取物对CCl4导致的大鼠慢性肝损伤具有良好的预防保护作用。同时，给予CCl4和大果山楂总黄酮提取物的各组大鼠的肝脏组织匀浆丙二醛(MDA)含量低于模型组、超氧化物歧化酶(SOD)含量含量高于模型组，提示大果山楂总黄酮提取物对CCl4导致的大鼠慢性肝损伤的保护作用是通过清除自由基，抑制肝脏细胞脂质过氧化反应，稳定肝细胞膜而达到的。
       【参考文献】
         　　［1］广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准(1990年版)［S］.南宁:广西科技出版社,1992:21,22,139.
       
       ［2］李仪奎,王钦茂.中药药理实验方法学，第1版［M］.上海:上海科学技术出版社出版，1991：464.
       
       ［3］李素婷,杨鹤梅,石艳华,等.黄芩茎叶总黄酮对小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.承德医学院学报,2003,20(4):292.
       
       ［4］谢秋里，王功遂，刘梅华，等.白蛋白、球蛋白、白/球比值与肝组织病理关系［J］.现代医药卫生, 2005，21（13)：1638.