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       【摘要】 
       目的探讨大孔吸附树脂法纯化紫萍总黄酮的工艺。方法将AB-8，HPD-450和HPD-600 3种大孔吸附树脂对紫萍总黄酮的吸附效果进行了比较，并对AB-8的吸附特性进行了研究。结果AB-8，HPD-450和HPD-600对紫萍总黄酮的吸附量分别为：80.04，82.26和75.96 mg/g，解吸率分别为90.47%，80.88%和75.84%。AB-8纯化紫萍总黄酮的工艺条件为：上柱样品pH值为5～6，以1BV/h的速度流过树脂，待吸附平衡后，用4BV的蒸馏水以2BV/h的速度淋洗树脂，然后用70%的乙醇溶液以1BV/h的流速进行洗脱，收集第2～3BV时的洗脱液，其干燥品中的黄酮纯度可达80%左右。结论AB-8型大孔吸附树脂最适合于紫萍总黄酮的分离纯化。
       【关键词】  大孔吸附树脂 紫萍 总黄酮
       Study on the Isolation of the Total Flavonoids from Spirodela polyrrhiza(L.) Schleid by Macroporous Absorption Resin
       PENG Liang, LI Zhimin
        
       (The School of Pharmacology, Jiangxi Scientific & Technological Normal University, Nanchang, Jiangxi, 330013, PR China)
       Abstract:ObjectiveTo study the techology for isolation of the total flavonoids from Spirodela polyrrhiza (L.) Schleid.MethodsThe absorption quantity and desorption rate of three kinds of macroporous absorption resins(AB-8,HPD-450,HPD-600) were compared,and the isolation characteristics of AB-8 on total flavonoids were studied.ResultsThe static absorption quantities of three macroporous absorption resins were 80.4,82.26,75.96mg/g,and the desorption rate were 90.47%，80.88% and 75.84%.The optimized conditions of AB-8 isolating total flavonoids were to elute with 4BV water solution by 2BV/h,desorb with 4BV70% ethanol by 1BV/h and collect the ethanol  solution at 2-3BV volume.ConclusionAB-8 most fitted for the isolation of total flavonoids in three tested resins.
       Key words:Macroporous absorption resin；  Total flavonoids；  Spirodela polyrrhiza (L.) Schleid
       
       大孔吸附树脂（macroporous adsorption resin）是一类人工合成的、具有多孔网状结构和表面活性的高分子材料。同其它的吸附剂相比，大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、再生简单、使用寿命长、溶剂消耗少、操作简便、安全等优点。目前，大孔吸附树脂已经广泛地应用在食品、化工、环保、医药工业和临床鉴定等领域。
       
       利用大孔吸附树脂进行分离和纯化中草药中的有效成分，已经越来越受到人们的重视。自20世纪90年代以来，大孔吸附树脂被用于黄酮类化合物、皂苷类、生物碱类等成分的分离［1］。本试验拟选用3种国产大孔吸附树脂，较为系统的对紫萍总黄酮的吸附量、解吸率及影响因素进行研究，以期为紫萍总黄酮的精制选择适宜的大孔吸附树脂，并为其工业化生产提供基本的工艺参数。
       1  器材
       1.1  材料上柱样品：紫萍全草购自沙坪大药房。用1∶10料液比的60%乙醇溶液于60℃下提取2 h，重复2次，合并提取液，减压浓缩。浓缩液再用粘度为30 Pas的壳聚糖溶液于60℃，pH 5.5的条件下絮凝除去浓缩液中的大部分蛋白质，过滤后得到上柱样品。
       
       大孔吸附树脂，AB-8型大孔吸附树脂购自南开化工厂；HPD-450型和HPD-600型大孔吸附树脂购自河北沧州宝恩化工有限公司。基本物理性质见表1。表1  实验用吸附树脂的基本性质（略）
       1.2  仪器
       旋转蒸发器RE-52型（上海青蒲沪西仪器厂）；紫外可见分光光度计756MC型（上精密仪器有限公司）。
       1.3  试剂无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等试剂均为分析纯。
       2  方法
       2.1  大孔树脂对紫萍总黄酮吸附量的测定准确称取经预处理的干树脂各1.0g，置于具塞磨口三角瓶中，精确加入上柱样品20 ml，密封后置于振荡培养箱(28℃，100次/min)中振荡24 h。充分吸附后，过滤，测定滤液中总黄酮的浓度，按下面的公式计算对总黄酮的吸附量（mg/g）。
       Q=（Co-Cr）VW      (式1)
       Q：吸附量（mg/g）；Co：上柱液初始黄酮浓度（mg/ml）；Cr：滤液中黄酮浓度（mg/ml）；V：加入上柱液体积（ml）；W：大孔吸附树脂质量（g）
       2.2  紫萍总黄酮解吸率的测定将“2.1”中过滤后得到的大孔树脂放入三角瓶中，加入50 ml 95%的乙醇溶液，密封后置于振荡培养箱(28℃，100次/min)中振荡24 h，使总黄酮解吸附，过滤得滤液，测定滤液中总黄酮的含量，按照下面的公式计算总黄酮的解吸率。
       D=CVQW×100%   （式2）
       D：解吸率（%）；C：滤液中黄酮含量（mg/ml）；V：所加乙醇的体积（ml）；Q：树脂吸附黄酮的量（mg/g）；W：大孔吸附树脂的质量（g）
       2.3  大孔树脂对紫萍总黄酮的动态吸附实验称取一定质量的大孔吸附树脂湿法装柱，上柱样品总黄酮浓度为2 mg/ml，上柱液以1 BV/h(树脂床体积，Bed volume，BV)速度通过树脂柱床，共处理6 BV上柱样品，每处理1 BV料液的流出液单独收集，测定其中总黄酮的浓度。
       2.4  解吸实验将上柱液以1 BV/h的流速流过AB-8吸附树脂，使树脂充分吸附平衡。先用4 BV的蒸馏水以2 BV/h流速淋洗，然后分别采用30%，50%，70%和90%浓度的乙醇以1 BV/h流速进行解吸。实验时连续不断地注入乙醇解析液，每0.5 BV流出液收集，测定流出液中总黄酮的含量。
       2.5  黄酮含量的检测准确称取木犀草素0.1 g，用30%乙醇溶解，并完全转入500 ml容量瓶中，用30%乙醇定容。分别取上述木犀草素标准溶液1，2，3，4，5，6 ml，置于6 只25 ml 容量瓶中，用30%乙醇补充至6 ml，加入0.75 ml NaNO2溶液后摇匀，静置5 min。再向其中加入0.75 ml的Al(NO3)3溶液后摇匀，静置6 min。最后加入1 mol/L的NaOH溶液5 ml，并30%的乙醇定容至刻度，摇匀后静置10 min。于510 nm下，以未加显色剂的待测液为空白，用分光光度计测定其吸光度。以测得的不同浓度下的吸光值作标准曲线。用最小二乘法作线性回归，求得木犀草素浓度C（mg/ml）与吸光度A的关系曲线的回归方程式。
       取2 ml的待测液，置于25 ml的容量瓶中，加入30%的乙醇补至6 ml。按照上述的方法显色后于510 nm下，以未加显色剂的待测液为空白，用分光光度计测定其吸光度。由标准曲线所得的回归方程计算出待测液中黄酮的浓度。
       3  结果
       3.1  标准曲线以木犀草素标准品的浓度为横坐标，以在510 nm下测得不同浓度的木犀草素标准品的吸光值为纵坐标，做标准曲线，见图1。
       对图1中的数据进行线性回归得木犀草素标准品浓度C（mg/ml）与吸光值（A）的方程：C= 0.079 3×A + 0.002 4（相关系数 r＝0.999 5）。
       3.2  3种树脂对紫萍总黄酮的吸附与解吸实验本实验选用了3种不同型号的大孔吸附树脂对紫萍提取物进行了分离纯化，考察了它们对总黄酮的吸附和解吸能力。
       3.2.1 吸附结果表2列出了AB-8，HPD-450和HPD-600 三种型号的大孔吸附树脂对紫萍总黄酮的吸附能力。由表中的结果可以看出，三种树脂对紫萍总黄酮的吸附能力都比较强，吸附率均超过了70%。其中HPD-450的吸附能力最强，为82.26 mg/g。
       3.2.2  解吸结果表3列出了AB-8、HPD-450和HPD-6003种型号的大孔吸附树脂对紫萍总黄酮的解吸能力。由表中的结果可以看出，在95%的乙醇溶液中，3种树脂对紫萍总黄酮的解吸能力都比较强，解吸率均超过了70%。其中AB-8的解吸能力最强，解吸率达到了90.47%。
       吸附量和解吸率是大孔吸附树脂在提取和分离天然产物时需要考虑的重要参数，它不仅要求吸附树脂对目标物质具有较高的吸附量，同时还应该具备较高的解吸率。综合吸附量和解吸率，在对紫萍总黄酮的纯化过程中，AB-8是一种较为理想的吸附树脂，因此，在后续实验中，将选择AB-8型树脂。表2  3种树脂的吸附量（略）表3  3种树脂的解吸率（略）
       3.3  AB-8对紫萍总黄酮纯化条件的研究
       3.3.1  pH值对吸附量的影响本实验研究了pH值对AB-8树脂纯化紫萍总黄酮的影响，上柱样品中，总黄酮的初始浓度为4.63g/ml，结果见图2。上柱样品的pH值对AB-8大孔吸附树脂吸附紫萍总黄酮有一定的影响，随着pH值的升高，吸附量呈先升高后降低的趋势，在pH为5.5时吸附量最大，但是与pH为5和6时的吸附量相差不大。所以在本实验条件下，选择上柱液的pH在5～6之间较为合适。
       3.3.2  AB-8树脂的等温吸附线在室温下，用不同总黄酮浓度的上柱样品来探讨上柱样品中的总黄酮浓度对AB-8树脂吸附量对影响。以吸附量为纵坐标，吸附平衡时溶液中的黄酮浓度为横坐标做图，得到一条吸附等温曲线，见图3。
       由图3可知，随着溶液平衡浓度的增加，树脂的吸附量也随着增大，逐步趋于最大值。这说明AB-8树脂对紫萍总黄酮的吸附符合Langmuir模型，属于单分子层吸附。平衡溶液的浓度与树脂的吸附量可用以下公式表示：
       q=q∝bCf1+bCf  （式3）
       式中：q为吸附量（mg/g）；b为吸附平衡常数；q∝为饱和吸附量（mg/g）；Cf为平衡时溶液中总黄酮的浓度（mg/ml）。
       上式可改写成：
       Cfq=1qα·Cf+1q∝b  (式4)
       以Cfq对Cf作线性回归，可得线性方程：Cfq=0.009 6Cf+0.002 42（r＝0.996 9），由直线的斜率可求得饱和吸附量q∝＝104.17（mg/g），由截距可求得平衡常数b＝3.97。
       3.3.3  AB-8大孔吸附树脂的动态吸附效果称取一定质量的AB-8树脂湿法装柱，通过测定流出液中总黄酮的浓度，可以反应出在上柱样品流动过程中，树脂对总黄酮的饱和吸附量的变化。结果见图4。从图4可以看出，当上柱样品中总黄酮浓度为2 mg/ml时，在第1,2，3树脂床体积的流出液中，总黄酮的含量都较低，说明此时AB-8对黄酮的吸附较好，仅有少量的泄露。但在第4树脂床体积流出液中时，总黄酮浓度明显升高，说明上柱样品的体积在3倍树脂床体积到4倍树脂床体积时，AB-8对总黄酮的吸附量达到饱和。假设上柱液体积在3 BV时，树脂吸附达到饱和，由此可以计算出AB-8对总黄酮的动态吸附饱和量是理论饱和量的69.18%。可见上柱液的流动对AB-8的吸附能力有一定的影响。在此后的实验中，将上柱样品中的总黄酮含量调至2 mg/ml，上柱液体积控制在3倍树脂床体积以内，流速为1 BV/h。
       3.3.4  乙醇浓度对AB-8树脂洗脱效果的影响将黄酮浓度为1.5 mg/ml的3 BV上柱样品以1 BV/h的流速流过AB-8吸附树脂，使树脂充分吸附平衡，先用4 BV的蒸馏水以2 BV/h流速淋洗，然后分别采用30%，50%，70%和90%浓度的乙醇以1 BV/h流速进行解吸。解吸液中总黄酮浓度和分离效果见表4和图5。表4  乙醇浓度对AB-8树脂中总黄酮分离的影（略）
       4种不同浓度的乙醇溶液，在5倍树脂床体积时，均已到达该浓度乙醇溶液的最大分离效果。其中，30%的乙醇仅能解吸大约9.40%的黄酮，说明30%的乙醇不适合于紫萍总黄酮的分离。50%的乙醇分离效果相对30%而言，有了较大的提高，其解吸率达到了51.59%，但从图5中可见，该浓度的乙醇溶液在洗脱时，黄酮类化合物在洗脱液中分布范围较大，从1.5倍树脂床体积到3.5倍树脂床体积的洗脱液中，黄酮的含量都比较高。70%和90%的乙醇溶剂，洗脱能力相当，解吸率相差不大，而且从图5反映出，这两个浓度的乙醇溶液的解吸曲线较为尖锐，说明黄酮在洗脱时较为集中，这样有助于减少杂质的混入。从节省成本方面考虑，选择70%的乙醇溶液作为洗脱液。
       4  讨论
       大孔吸附树脂为吸附性和选择性原理相结合的分离材料。与离子交换树脂分离不同，它本身具有的吸附性，是由于范德华引力或产生氢键的结果，选择性由其多孔性结构所决定［2］。对于影响大孔吸附树脂分离效果的因素，人们看法不一。Thurma等人认为大孔吸附树脂的孔径、孔度和比表面积决定了树脂的吸附效果，Abrams提出树脂的骨架结构、功能基性质是影响树脂吸附的重要因素，何炳林等［3］认为吸附树脂的吸附作用不仅与树脂的理化性质有关，而且还与吸附质的性质、介质的性质、操作方法等因素有关。总之，影响树脂吸附的因素较多，但树脂的骨架结构(决定极性的大小)和空间结构(孔表、比表面、孔容)等是其重要的影响因子。
       
       据相似相溶的原理，极性树脂易于吸附极性物质，非极性树脂易于吸附非极性物质，而弱极性树脂既可吸附非极性物质，也可吸附极性物质。本实验中需要分离的总黄酮在弱极性的两种吸附树脂AB-8和HPD-450上都有较大的吸附量。但是由于AB-8的解吸率要高于HPD-450，所以AB-8更加适合于紫萍中总黄酮的分离。
       利用大孔吸附树脂对天然产物中的有效成分进行分离，必须根据目标化合物的结构特点综合考虑各种影响因素。样品的预处理、溶剂系统的选择、上柱液流速、树脂粒度、上柱液温度等因素都会影响树脂的分离效果。溶剂系统的选择涉及吸附介质、淋洗介质和解吸介质的选择，在树脂的应用中尤为重要。溶剂系统不仅影响树脂的溶胀特性，而且还影响树脂的吸附特性，对于吸附介质、淋洗介质的选择应以降低吸附质的溶解度为准，而对解吸介质的选择则应以增加吸附质的溶解度为原则。由于紫萍中既含有黄酮苷元又含有黄酮苷，因此，要求解吸液的乙醇浓度要比较高，才能将这两类极性不同的物质较为集中的洗脱。实验结果表明70%和90%的乙醇溶液的解吸效果都比较理想，但是从节约成本这一角度考虑，选择70%的乙醇作为解吸介质较好。
       【参考文献】
         　　［1］史作清, 施荣富, 范荣鸽, 等.树脂吸附法在中草药有效成分提取中的应用［J］.中草药, 2001, 32(7)：660.
       
       ［2］李伯庭, 王 湘, 李小进.大孔吸附树脂在天然产物分离中的应用［J］.中草药,1990, 21(8)：42.
       
       ［3］何炳林, 黄文强.离子交换与吸附树脂［M］. 上海：上海科技教育出版社,1995：319.