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       【摘要】 
       目的研究党参多糖对神经干细胞硫代硫酸钠损伤的保护作用。方法采用离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化得到党参多糖；取出大鼠胚胎纹状体进行神经干细胞培养，神经干细胞硫代硫酸钠损伤模型模拟脑梗死中神经元的缺氧性损伤。实验分正常对照组，硫代硫酸钠损伤组和将不同浓度党参多糖加入硫代硫酸钠损伤组培养液中的试验组。观察硫代硫酸钠损伤后各组神经干细胞死亡率和乳酸脱氢酶漏出率，研究党参多糖对神经干细胞硫代硫酸钠损伤的保护作用。 结果加入多糖的实验组神经干细胞损伤有不同程度的减轻。高浓度多糖实验组神经干细胞死亡率和乳酸脱氢酶漏出率较低，与硫代硫酸钠损伤组比较有显著性差异。 结论党参多糖对神经干细胞硫代硫酸钠损伤有明显的保护作用。
       【关键词】  党参多糖 分离纯化 神经干细胞 硫代硫酸钠损伤
       Protective Effect of polysaccharides from Codonopsis Pilosula on Neural Stem Cell Injury Induced by Na2S2O3
       WU Bingfeng,YANG Juan, XIE Hong ,  YANG Xiaosheng
       1. The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002 China;
       2.  College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
       Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of polysaccharide from Codonopsis pilosula (CPP-1) on neural stem cell injury induced by Na2S2O3.  MethodsCPP-1 was obtained by ion change column chromatography and gel chromatography; the neural stem cells were cultured from the striatum of fetal mice and damaged by Na2S2O3 to simulate hypoxic-ischemic brain injury. The animals were divided into control group, Na2S2O3 group and test groups with different concentrations of polysaccharide. The cell death rate and LDH leakage were observed. ResultsThe neural stem cell damage of test groups were alleviated, the death rate of neural stem cells and LDH leakage in high concentration test group were induced much lower than those of Na2S2O3 group. ConclusionCPP-1 has remarkable protective effect on neural stem cell injury induced by Na2S2O3.
       Key words:Polysaccharide;   Codonopsis pilosula;   Purification;   Neural stem cells;    Na2S2O3 damage
       
       党参Codonopsis pilosula为桔梗科党参属植物,是我国传统补益药。味甘、性平、有补中益气、健脾益肺、生津的功效［1］。其主要活性成分之一党参多糖具有抗肿瘤［2］、增强免疫功能［3］、增强抗应激能力［4］及抗氧化等［5］多种药理活性，药理实验多用的是多糖粗品。本研究从党参中分离纯化得到一个分子量分布均一纯级分，并就其对神经干细胞硫代硫酸钠损伤的保护作用进行研究，为进一步加强党参多糖药理学研究，提高其应用价值提供科学依据。　　
       1  器材与方法
       1.1  试剂与仪器
       党参 (贵阳市药材市场)；DEAE-纤维素 (上海试剂二厂)；Sepharose CL-6B (Pharmacia)；硫代硫酸钠为国产分析纯试剂；鼠抗巢蛋白（nestin）抗体(Chemicon)；Trizol (上海生工)；连有FITC荧光素的二抗(羊抗鼠)(上海基因公司)；多聚甲醛(华美公司)。紫外可见分光光度仪HP-8453（惠普公司）；电泳仪DYY-Ⅲ8B（北京市六一仪器厂）；免疫荧光显微镜（Olympus）；1815TC CO2培养箱（SHEL-LAB）；倒置显微镜（Nikon）。
       1.2  方法
       1.2.1  党参多糖的分离纯化 
       党参样品真空干燥至恒重后粉碎，用80%乙醇脱单糖及低聚糖，热水浸提多糖，党参提取液减压浓缩至适当体积后，用乙醇沉淀，乙醇最终浓度不低于80 %，沉淀干燥后得党参多糖粗品CPP。CPP用水溶解后上 DEAE-纤维素柱，依次用蒸馏水和不同浓度的NaCl溶液洗脱，洗脱液分部收集，用苯酚-硫酸法检测。多糖高峰部分合并，透析脱盐，透析液浓缩后进一步用Sepharose CL-6B凝胶柱纯化，用0.2 mol/ L NaCl洗脱，洗脱液逐管用硫酸-苯酚法检测。以接收管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，收集多糖检测曲线符合正态分布的对应管，真空干燥得到党参的各个级分。从各级分中筛选出一个级分CPP-1进行理化性质分析及活性试验。
       1.2.2   纯度鉴定 
       见文献［6］。
       1.2.3  神经干细胞的培养与鉴定 
       无菌条件下取出大鼠胚胎的纹状体，放入含有1 % B27， 20 μg/L表皮生长因子（EGF），10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的F12-DMEM（1∶1）培养基中，吹打制成细胞悬液，于37 ℃，5 % CO2饱和湿度下常规培养，每培养1 周传代1次。将细胞贴附在载玻片上生长，2 d后取出。吸出培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗去残余培养液，4 %（M/M）多聚甲醛固定20 min。PBS洗2次；10 %正常山羊血清封闭1 h；PBS洗3次；抗nestin抗体（V/V 1∶100，用抗体稀释液稀释）4 ℃过夜，PBS洗3次；二抗（V/V 1∶50, 用抗体稀释液稀释）32 ℃孵育1 h，PBS洗3次；50 %（V / V）甘油封片，观察荧光（图1）。
       1.2.4  脑缺氧体外模型的构建  
       将1 ml密度为5×105/ml细胞悬液置于24孔板中，加入浓度为250 mmol / L的硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液20 μl，使硫代硫酸钠溶液浓度为5 mmol / L，混匀，置于37 ℃，5 % CO2的培养箱中培养，每隔24 h观察并细胞计数（用1.5 %台朌蓝染色，计算150个总细胞中活细胞的百分率）。
       1.2.5  分组  
       正常对照组：正常神经干细胞培养液；硫代硫酸钠损伤组：方法如“1.2.4”项所述。试验组：不同浓度CPP-1加入硫代硫酸钠损伤组培养液中形成3个亚组，即低浓度组（25 μmol/L ）、中浓度组（50 μmol/L ）和高浓度组（100 μmol/L）。
       1.2.6  检测指标 
       神经干细胞死亡率： 将1 ml密度为5×105/ml各组细胞悬液置于24孔板中，置于37 ℃，5 % CO2的培养箱中培养，观察并计算活细胞的百分率(1.5 % 台朌蓝染色，显微镜下计数150个总细胞)；乳酸脱氢酶（LDH）漏出率：各组换无血清培养液12 h后收集上清液，用速率法测定细胞外液中LDH活性。
       1.3 统计分析  
       结果以 ±s表示，数据经t检验判断显著性意义。
       2  结果
       2.1  党参多糖的理化性质   
       CPP-1经凝胶柱层析，洗脱液经酚硫酸法检测，以洗脱管数为横坐标，吸光值为纵坐标作图得到单一对称峰；经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用阿利新蓝染色，结果表现为单一区带。以上两种方法表明其为分子量分布均一的多糖纯级分。硫酸-苯酚、硫酸-咔唑反应呈阳性；菲林试剂、碘-碘化钾反应呈阴性，280 nm处无紫外吸收峰，表明CPP-1中含多糖、糖醛酸，不含还原糖、蛋白质、淀粉。
       2.2  党参多糖对神经干细胞硫代硫酸钠损伤的保护作用  
       倒置显微镜下观察可见，硫代硫酸钠损伤组干细胞胞体肿胀，折光性差，有大量的细胞碎屑，仅有少量的细胞存活（图2，图中团状物为活细胞群，其余为碎屑）。而CPP-1实验组神经干细胞损伤有不同程度的减轻，见图3。
       计算神经干细胞死亡率和LDH漏出率，结果见表1。由表1可知，硫代硫酸钠损伤组培养液中细胞死亡率和LDH漏出率明显增加，与对照组比较有显著性差异（P<0.01）。CPP-1高浓度组神经干细胞培养液中细胞死亡率和LDH漏出率相对较小，与硫代硫酸钠损伤组比较有显著性差异（P<0.01）。说明一定剂量CPP-1对神经干细胞缺氧损伤有明显的保护作用。在实验浓度范围内，党参多糖对神经干细胞损伤的保护作用与其浓度呈现一定的量-效关系。
       3  讨论
       多糖及其复合物所具有的多方面的生物活性已引起生物学界、化学界、医药界的极大兴趣。多糖作为一种非特异性免疫增强剂对机体发挥作用：如抗肿瘤，抗病毒特别是抗艾滋病、抗炎和抗辐射以及降血糖、抗凝血、抗消化溃疡、抗衰老、清除自由基等方面的作用已有大量文献报道［7］。而本研究发现党参多糖对神经干细胞硫代硫酸钠损伤的保护作用还未见报道。笔者曾报道过刺梨多糖对神经干细胞硫代硫酸钠损伤的保护作用，该作用是否像多糖免疫增强功能一样，是许多种类多糖共有的活性，这个问题有待于进一步的实验研究。表1   CPP-1对神经干细胞死亡率和LDH漏出率的影响（略）
       神经干细胞已成为近期研究的热点。神经干细胞分布广泛，在人胚胎或成年哺乳动物及人的近侧脑室的室管膜下层、室下区、纹状体、海马齿状回、隔区、小脑和脊髓等部位均已分离培养出神经干细胞［8］。体外神经干细胞培养是研究天然产物对神经系统药理作用的一种较好的方法。
       神经干细胞硫代硫酸钠损伤模型能够较好模拟体外整体动物的脑缺氧状态，便于分析研究细胞损伤后的恢复过程及药物的保护作用。CPP-1对神经干细胞硫代硫酸钠损伤的保护作用，可能与其具有较强的抗氧化作用有关。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会. 中国药典 （Ⅰ部）［S］.北京：化学工业出版社, 2000：233.
       
       ［2］张华荣,姜国辉.党参药理与临床研究进展［J］.中医药信息,1996，13(5): 17
       
       ［3］张兆林, 兰中芬, 王凤连, 等. 党参多糖成分及其免疫药理作用研究［J］.兰州医学院学报，1988,3:14.
       
       ［4］李伟, 曲淑岩, 梁春华, 等. 党参多糖的抗缺氧作用［J］.吉林中医药, 1989,5:35.
       
       ［5］李贵荣,杨胜圆. 党参多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用［J］.化学世界, 2001,42(8):422.
       
       ［6］杨娟, 吴谋成, 张声华. 香菇子实体蛋白多糖的分离纯化及组成结构分析［J］.植物资源与环境学报, 2001,10(2):4.
       
       ［7］田庚元，冯宇橙，林 颖.植物多糖的研究进展［J］.中国中药杂志，1995,20(7):441.
       
       ［8］Kukekov V G, Laywell E D, Suslov O, et al. Multipotent stem progenitor cells with similar properties arise from two neurogenic regions of adult human brain［J］.Exp Neurol, 1999,156 (2)：333.