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       【摘要】 
       目的研究高频电火花水针疗法对骨关节炎家兔NO及软骨细胞凋亡的影响。方法应用关节制动的方法复制骨关节炎模型，18只造模成功的中国家兔，随机分为高频电火花水针组（简称A组）、水针刀组（简称B组）和对照组（简称C组），A组用高频电火花水针加手法治疗，B组水针刀加手法治疗，C组仅予以手法治疗。1次/d，疗程为1个月，用硝酸还原法检测关节滑液中NO含量；用流式细胞仪检测软骨细胞的凋亡率。结果A、B、C组关节滑液中NO的含量分别为（33.67±17.72）μmol/L、（58.90±22.07）μmol/L，（83.30±16.20）μmol/L，软骨细胞的凋亡率分别为（25.27±10.82）%、（51.71±12.42）%和（74.80±9.37）%。3组间差异有统计学意义。结论与水针刀相比较，高频电火花水针疗法能更显著减少关节液NO的含量，抑制软骨细胞的凋亡，治疗膝骨性关节炎疗效好。
       【关键词】  膝骨性关节炎 细胞凋亡 一氧化氮 高频电火花水针疗法
       Effects of Drug Electric Acupotomy Therapy on Articular Chondrocyte Apoptosis in Rabbits
       GONG Quan, CHENG Chuanguo, CHENG Long
       1.School of Medical Science, Yangtze River University, Jingzhou 434000, China;
       2.Institute of Orthopedics and Traumatology, China Three Gorges University, Yichang 443002，China
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of drug-electric acupotomy (DEA) therapy on nitric oxide (NO) content and articular chondrocyte apoptosis in rabbits with Osteoarthis(OA).MethodsThe OA rabbit model was established by immobilized in full extension for up to six weeks. Eighteen rabbits were randomly divided into the DEA group (treated with DEA), the acupotomy  group (treated with acupotomy and manipulation) and the control group (treated with manipulation alone). The treatment was applied once every three days for 1 month as a course. NO in articular synovia was measured by nitrate reduction method, and the apoptosis rate of  chondrocyte was determined by flow cytometry. ResultsNO content in the A, B, and C groups  was（33.67±17.72）μmol/L,（58.90±22.07）μmol/L and（83.30±16.20）μmol/L respectively, and the apoptosis rate in the three groups was（25.27±10.82）%,（51.71±12.42）% and（74.8±9.37）% respectively. There was significant difference among the three groups. ConclusionCompared with the acupotomy plus drug manipulation, DEA plus manipulation could reduce the NO content in synovia fluid and inhibit the apoptosis rate of chondrocytes in treating osteoarthritis of knee joint.
       Key words：Osteoarthritis of knee joint;  Cell apoptosis;  Nitric oxide;  Drug electric acupotomy 
       
       骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为主要病理特征的慢性关节疾病。临床上以膝骨关节炎最为常见，尤其在老年人群中发病率高，由于对OA的发病机制缺乏足够的了解，目前尚未找到治疗OA的理想而有效的方法，但延缓关节软骨退变是从本质上防治OA的关键。本实验建立兔OA模型，观察高频电火花水针疗法对OA软骨细胞凋亡的影响。为该疗法在临床上的应用提供一定的科学依据。
       1  器材与方法
       1.1  动物与分组 
       实验选用8月龄左右，体重2.0～2.5 kg的中国家兔30只，雌雄不限，由武汉大学实验动物中心提供。造模前随机抽取3只为正常对照，27只行石膏固定。6周后因死亡等原因排除6只，剩下动物随机抽3只做病理分析，确定模型成功后随机分成3组，分别为高频电火花水针治疗组（A组）、水针刀组（B组）、和对照组（C组）每组6只。同等条件下分笼饲养。
       1.2  仪器和试剂 
       EPICS XL型流式细胞仪，美国BECKMAN COULTER 公司；754分光光度计，上海分析仪器总厂；DCH-2000X骨伤疼痛治疗仪（鄂食药监械（准）字（2005）第2260812号），三峡大学康复医学研究中心研制生产。Annexin Ⅴ-FITC 凋亡试剂盒，IMMUNOTECH 公司；胶原酶Ⅱ型，GIBCO 公司；NO试剂盒，南京建成生物工程研究所。
       1.3  方法
       1.3.1  造模方法先剪去所有动物右后肢踝关节以上的兔毛，用管型石膏将其右后肢伸直位固定，石膏外以透明胶纸封好，以防兔撕咬，如石膏松动或脱落及时重新固定。制动满6周时随机处死3只，取关节软骨作病理检查以观察造模情况，确定模型成功后解除石膏外固定。
       1.3.2  针刀制作
       将医用12号注射针头的针尖去掉，使之成斜坡形平直状刃口，保留针孔，磨光滑锋利，高压消毒备用。
       1.3.3  药物维生素B1注射液50 mg，维生素B2注射液5 mg，维生素B6100 mg，当归注射液2 ml，2%利多卡因注射液2 ml配制成混合液。以上注射液均为普通市售药品。
       1.3.4  治疗方法 
       造模成功1周后，将动物固定在兔台上，对患膝行经络诊察，于关节周围主要是髌骨周围、内外关节间隙等处找到条索状物并用龙胆紫定点，局部常规备皮、消毒。术者按术前常规双手消毒，左手固定进刀点，右手持针刀，刀口线与肌纤维或韧带走向平行，将刀锋压在皮肤上，使皮肤形成一长方形凹陷，使神经血管分离在刀的两旁，然后突然用力，针刀刺入皮肤，缓慢深入直达骨面，先作纵形疏通，然后再作横形剥离，如有结节务必切开，直至刀下有松动感时，停止上述操作，将套在针刀上的药液，缓慢注射，广泛浸润，同时在针柄处用DCH-2000X骨伤疼痛治疗仪施加高频电火花1～2 min。酒精棉球压迫针孔片刻，以不出血为度，然后用创可贴包扎针孔。每次选点2～4个，每点注射药液2～4 ml。手术完毕手法放松患膝周围的软组织，并对患肢行牵引拔伸和被动屈曲手法，此时多可闻及软组织松解的“喀嚓”声。以上治疗均1次/3d，10次为1个疗程。
       
       水针刀组：除不施放高频电火花外，其他治疗同高频电火花水针组。
       对照组：仅给予手法治疗。
       1.3.5  观察项目及检测方法
       1.3.5.1  关节液的抽取 施行膝关节穿刺，证实刺入关节腔后，注入0.9%的生理盐水1 ml，反复回抽、注入3次后，再尽量抽出腔内液体，1 000 r/min离心5 min，取上清液保存于-20℃冰箱中待测。
       1.3.5.2  软骨标本采集将兔敲击头部致死后，立即切开右膝关节腔，先大体观察关节软骨、滑膜的病变。然后用锐利刀片切取胫骨平台和股骨下髁边缘的软骨组织。
       1.3.5.3  关节滑液NO的测定 用硝酸还原法，操作按相应试剂盒说明书进行。
       1.3.5.4  软骨细胞凋亡率分析 将所取软骨组织于含Hank"s液的培养皿中反复清洗，清除软骨表面的血液及可能误带的滑膜组织，移入0.2%胶原酶Ⅱ型（0.1 g软骨组织加2 ml含4 mg胶原酶的Hank"s液中）小瓶中，用眼科剪剪碎，越细越好，在37℃水浴中持续轻微搅拌下消化1 h。消化结束后，将含有细胞的酶溶液200目不锈钢筛网进行过滤，1500 r/min离心10 min，弃上清液，调整细胞浓度至1×105/ml。将上述单细胞悬液200目再过滤，取0.1 ml样本至冰浴中，加Annexin Ⅴ-FITC 5μl，混匀15 s，加PI染液2.5 μl，冰浴中避光反应15～20 min，加反应缓冲液0.5 ml，上机检测。
       2  数据统计
       应用SPSS11.0软件进行分析。
       3  结果
       3.1  关节液中NO的含量　
       结果见表1。表1  各组关节液中NO的水平比较（略）
        方差齐性检验，P=0.710，总体方差齐同，ANOVA分析，F=10.436，P=0.001，各均数间有显著性差异，按α=0.05显著性检验标准，用S-N-K法作多重的两两比较，A组和B组、A组和C组、B组和C组间的差异均具有统计学意义。
       3.2  软骨细胞凋亡率流式分析结果见表2。表2  软骨细胞的凋亡率（略）
       方差齐性检验，P=0.972，总体方差齐同，ANOVA分析，F=30.778，P<0.001，各均数间有显著性差异，按α=0.05显著性检验标准，用S-N-K法作多重的两两比较，A组和B组、A组和C组、B组和C组间的差异均具有统计学意义。
       4  讨论
       4.1  造模原理制动建立的膝骨性关节炎动物模型，在组织学及生化改变等方面酷似临床所见的膝骨关节炎，其机理主要在于，兔膝关节伸直位固定时：由于限制了关节的运动，跨越关节的肌肉、关节囊持续收缩，使关节面的压力增加，同时异常压力状态下粘蛋白、透明质酸的成分减少，导致关节面的机械磨损；滑膜与软骨的粘连影响了软骨细胞营养的摄取，软骨细胞发生退变；关节局部血流滞缓，骨内压增高［1］。
       4.2  细胞凋亡与骨关节炎细胞凋亡（apoptosis）是细胞遵循一定的程序，通过激活内源性DNA内切酶，自我结束生命的生理性死亡。软骨细胞凋亡在OA发病中起重要作用，与软骨细胞减少，软骨基质降解密切相关。Blaw等［2］用TUNEL法、透射电镜和FACS发现OA病人软骨细胞中有典型的细胞凋亡，且细胞凋亡数量和OA分级明显相关。彭丹［3］应用兔膝关节伸直位石膏管型固定造成的实验性OA模型，结果显示：制动1周时即出现软骨表层细胞凋亡，6周时出现全层软骨细胞大量凋亡，而正常及实验对照组很少出现凋亡细胞。Ⅱ型胶原缺乏的软骨细胞容易发生凋亡［4］，也有人［5］认为Ⅴ型胶原纤维的表达是引起软骨细胞凋亡的原因。同其他细胞一样，软骨细胞的存活依赖于癌基因之间的平衡［6，7］。bcl-2和bax共同参与了软骨细胞凋亡的调节，bcl-2抑制细胞凋亡，bax与bcl-2的作用相反；如bcl-2过量，形成bcl-2二聚体，那么细胞就存活，如bax过量，形成bax二聚体，那么细胞就走向凋亡。c-myc，fas，p53等也参与软骨细胞凋亡的调节。软骨细胞凋亡的途径主要有两条，即Fas介导和NO诱导的细胞凋亡。这是两个独立的通路，并且在OA中，NO依赖通路更为重要。彭丹等［3］的研究发现，抑制NO的分泌，可以减轻实验性骨关节炎软骨细胞的凋亡。
       4.3  高频电火花水针疗法治疗骨关节炎的机理探讨高频电火花水针疗法［8］是集药物、针刀、高频电火花于一体的治疗方法。改制的针刀既保留了原有的注射功能，又具备了小针刀的特性。其在病灶处或压痛点进行疏通、剥离，将毛糙不平的骨刺及疤痕组织铲除，能使受损处肌腱和肌间膜的挛缩、粘连得到松解，使循环通畅、肿胀消除，肌肉的动态平衡得到恢复；注入的维生素B族类药物能营养血管和神经、肌肉组织；中药当归能活血通络，消炎镇痛，缓解粘连；骨伤疼痛治疗仪通过高频放电形式的高电压、低电流，在病灶周围形成一个高频电磁场，使机体病灶范围内带电颗粒产生带有良性扩散的均衡震荡，能改善病变部位的血液循环及局部缺血缺氧状况，促进炎症和被剥离的细小组织物的吸收；针刀的针刺作用及高频电的刺激作用，能通经活络。总之，高频电火花水针疗法能消除骨关节的无菌性炎症，松解粘连，恢复关节的动态平衡，同时血液循环的改善有利于降低骨内压和氧自由基的清除，有利于软骨基质的合成，和关节内软骨的修复，因此采用此方法治疗膝骨性关节炎，其疗效显著。
        本实验研究发现，高频电火花水针疗法能降低关节局部NO的含量，进而抑制软骨细胞凋亡，为该疗法治疗膝骨性关节炎提供了一定的科学依据，但其对凋亡调控基因，特别是bcl-2和bax的表达有何影响，以及该疗法治疗骨关节炎的其他可能机制有哪些，这些都有待于我们作进一步的研究。
       【参考文献】
         　　［1］聂林,张学义,陈国瑞,等.骨关节炎的动物模型［J］.中华实验外科杂志,1990,7（2）:96.
       
       ［2］Blaw FJR,Guistian R,Vazguez ME,et al.Osteoarthritis chondtrocytes did by apoptosis :A possible pathway for osteoarthritis pathology［J］.Arthritis Rheum,1998,41(2):284.
       
       ［3］彭 丹,孙材江.实验性骨关节病中软骨细胞的凋亡［J］.湖南医科大学学报,1999,24（5）:415.
       
       ［4］Yang C,Li SW,,helminen HJ,et al. Apoptosis of chondrocyte in transgenic mice lacking collagen Ⅱ［J］.Exp cell Res,1997,235:370.
       
       ［5］Gibson ,Lin DL,Roque M. Apoptosis of terminally differentiated Chondrocyte in culture［J］.Exp Cell Res,1997,233:372.
       
       ［6］卢思俭,单 玲,张华东,等.兔骨关节炎软骨细胞中中bcl-2、bax mRNA及蛋白表达的意义［J］.中华风湿病学杂志,2006,10(7):413.
       
       ［7］龚 权.细胞凋亡与骨性关节炎研究进展［J］.湖北省卫生职工医学院学报,2004,17(4):92.
       
       ［8］程传国,龚 权.药物电针刀疗法治疗创伤性踝关节炎的临床报告［J］.中国中医骨伤科杂志,2002,10(3):47.