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       【摘要】 
       目的建立同时测定杜仲药材中绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷含量的高效液相色谱(HPLC)法。方法采用Diamonsil C18柱（5 μm ，250 mm×4.6 mm），以乙腈水0.4%磷酸水溶液（15∶85∶0.5）为流动相，检测波长227 nm。结果样品中绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的加样回收率分别为95%～98%，96% ～103%；绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的线性范围分别为0.298～2.98 μg,r=0.999 9和0.872～8.72 μg ，r=0.999 8。结论贵州不同产地杜仲药材皮及叶中绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含量差异很大。
       【关键词】  高效液相色谱法 杜仲 绿原酸 松脂醇二葡萄糖苷
       HPLC Method for Determination of CGA and PDG in  Eucommia ulmoides Oliv
       WU Qing, ZHANG Mingshi, WANG Xingning, CAO Guihong
       1.Guizhou Provincial Laboratory for Mountainous Environment（GLE）,Guiyang  550001,China；
       2.Biotechnology and Engineering College , Guizhou Normal University, Guiyang  550001, China;
        
       3.Center of Analysis and Test, Guizhou Normal University, Guiyang 550001,China
       Abstract:ObjectiveTo establish a new HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid（CGA）and pinoresind diglucoside（PDG）in E.ulmoides Oliv.MethodsCGA and PDG were analyzed on Diamonsil C18 column (5 μm，250 mm×4.6 mm ) with detector at 227nm,and the mobile phase consisting of CH3CNH2OH2PO3(15∶85∶0.5).ResultsThe recoveries of CGA and PDG were 95%～98%，96% ～103% respectively. The linear ranges were 0.298-2.98μg with a regression coefficient of 0.9999 for chlorogentic acid and 0.872～8.72 μg with a regression coefficient of 0.9998 for pinoresind diglucoside.ConclusionQuantitative analysis showed that there were significant different in the contents of CGA and PDG in the barks and leaves of E. ulmoides Oliv. from difference areas in Guizhou.
       Key words:HPLC；  E. ulmoides Oliv；  Chlorogenic acid；  Pinoresind diglucoside
       杜仲属国家二级保护植物，是杜仲科杜仲属的落叶乔木，中国特有植物种，系地质史上第四纪冰川运动残留下来的占生孑遗树种［1,2］。杜仲具有消炎、补肾降压、增强人体免疫力、抗疲劳、抗衰老等多种药理作用。其中，绿原酸（chlorogenic acid，CGA）和松脂醇二葡萄糖苷（pinoresind diglucoside,PDG）为杜仲药材中重要的活性物质［3,4］。近年来对杜仲药材的研究多限于杜仲叶活性成分的定量分析，而对杜仲皮中这两种活性成分定量分析甚少［5］。为了充分合理地开发利用杜仲资源，本实验采用高效液相色谱法同时对杜仲皮及叶中的绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷进行了定性定量分析。
       1  仪器与试药
       日本岛津Shimadzu LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD- 10Avp检测器，HW-2000 工作站（上海千谱）。
       绿原酸对照品（批号753-200311）及松脂醇二葡萄糖苷（由贵州德祥制药有限公司赠送纯度大于99%）对照均购于中国药品生物制品检定所；杜仲皮及叶均采自贵州各杜仲药材基地（经贵阳中医学院刘传汉老师鉴定）；乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸均为分析纯；水为二次重蒸水。
       2  方法与结果
       2.1  溶液的制备
       2.1.1  对照品储备液分别精密称取对照品适量，用60%甲醇溶解后置于25 ml的容量品，并稀释至刻度，配制成含绿原酸1.49 mg·ml-1，松脂醇二葡萄糖苷4.35 mg·ml-1的对照品储备溶液。
       2.1.2  对照品溶液分别精密吸取对照品储备溶液1 ml，置于10 ml的容量瓶中，用60%甲醇溶解并稀释至刻度，配制成含绿原酸0.149 mg·ml-1，松脂醇二葡萄糖苷0.435 mg·ml-1的对照品溶液。
       2.1.3  供试品溶液精密称取杜仲药材粉末（过60目筛）2 g，于100 ml锥形瓶中，加入25 ml 60%甲醇溶液，称定重量，在水浴上回流提取1 h，冷却后用相应的醇浓度补足重量。经0.45 μm的滤膜滤过，续滤液供HPLC分析。
       2.2  色谱条件色谱柱为Diamonsil C18柱（5 μm ，250 mm×4.6 mm），流动相为乙腈水0.4%磷酸水溶液（15∶85∶0.5），流速1 ml·min-1，柱温30℃，检测波长227 nm。在该色谱条件下，绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷分离良好，且不受药材中杂质的干扰。理论塔板数不小于3 000。见图1。
       2.3  线性关系考察分别精密吸取对照品溶液依次进样2，5，10，15，20  μl。按“2.2”色谱条件进行析，以Y为峰面积（uv.s），X为进样量（μg），绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的回归方程分别为：Y=267 175X+1 288.1，r=0.999 9，Y=188 306X+280.73,r=0.999 8。结果表明绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷分别在0.298～2.98，0.872～8.72 μg间呈良好的线性关系。
       2.4  精密度实验对同一份杜仲样品平行测定5次，绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的RSD分别为：0.23%，1.5%，n=5。
       2.5  重复性实验精密称同一份杜仲样品5份，按“2.1.3”方法制备供试品溶液，在“2.2”色谱条件下分别测定，绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的RSD分别为：0.76%，0.69%，n=5。
       2.6  回收率实验精密称取已测含量的杜仲药材粉末6份，每份2 g，按样品含绿原酸及松脂醇二葡萄糖苷的80%，100%，120%精密加入绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷对照品储备溶液，按“2.1.3”项的方法制备供试溶液，进样量10 μl。结果绿原酸及松脂醇二葡萄糖苷的回收率分别为95%～98%，96% ～103%；精密度（RSD）分别为0.8%～1.7%，1.5%～2.7%，n=3。结果见表1。表1  回收率实验结果（略）
       2.7  供试品溶液稳定性实验取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12 h测定，绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量的RSD分别为1.7%，2.2% ，n=7，表明供试品溶液在12 h内稳定。
       2.8  样品的测定分别取贵州不同产地的杜仲药材按“2.1.3”项方法制备供试品溶液、按“2.2”的色谱条件进行含量测定，结果见表2。实验结果表明，贵州不同产地的杜仲皮及叶中的绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的含量差异很大，杜仲叶中只含有绿原酸，未检出松脂醇二葡萄糖苷；且同一株杜仲药材皮及叶中的绿原酸含量有一定倍数关系；皮中的绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的含量无确定关系。因此，简单的一个指标不足以对杜仲药材质量进行评价。表2  杜仲药材含量测定结果（略）
       3  讨论
       3.1  提取容剂的选择绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷属于芳香族化合物，易溶于水及强极的溶剂中。本实验选择甲醇-水、乙醇-水和水3种溶剂作为提取溶剂。结果表明，以60%的甲醇作为提取溶剂时，绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷提取较完全。
       3.2  提取方法的选择本文考察了超声、回流、索氏提取3种提取方法，发现回流提取效率明显高于其他两种提取方法。实验中通过比较提取温度、料液比、提取时间对提取率的影响，结果为，以回流法提取、提取温度80℃、料液比0.08、提取时间1 h提取效果最佳。
       3.3  检测波长的选择绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的对照品溶液的紫外分析表明，绿原酸在220，246，232 nm，松脂醇二葡萄糖苷在227，280，288 nm有较强吸收，对各波长进行比较，发现在227 nm处两组分都具有较好的灵敏度，应此，选择227 nm为检测波长。
       本实验方法简便快速，准确，可用于杜仲药材及产品的质量控制和评价。
       【参考文献】
         　　［1］牛春山.陕西树木志［M］.北京:中国林业出版社，1940：128.
       
       ［2］任宪威.树木学［M］.北京：中国林业出版社，1997:362.
       
       ［3］李芳东，杜洪岩.杜仲［M］.北京：中国中医药出版社，2001:277.
       
       ［4］戚友维.杜仲化学成分研究进展［J］.中草药，1989，（4）：88.
       
       ［5］徐长根.RP-HPLC法测定杜仲中的松脂醇二葡萄糖苷［J］.药物分析杂志，2000，20（1）：56.
       
       ［6］彭密军.杜仲叶中绿原酸的提取分离及含量测定［J］.林业科技，1999，24（6）：41.
       
       ［7］张 敏. 科学种植、合理开发我省杜仲资源［J］.种子， 2002，（4）：74.