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       【摘要】 
       目的测定黑果枸杞叶片甲醇提取物对DPPH自由基、羟自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O·- 2）的清除能力。方法采用DPPH法、水杨酸法、邻苯三酚自氧化法分别测定黑果枸杞叶片甲醇提取物清除DPPH自由基、羟自由基和超氧自由基的能力。结果在实验条件下，黑果枸杞叶片甲醇提取物对超氧阴离子，羟自由基，DPPH自由基均有不同程度的抑制作用, 最高清除活性分别达72.72%，54.90%，92.08%。结论黑果枸杞叶片甲醇提取物对DPPH· ，·OH和O·- 2自由基均具有较好的清除作用。
       【关键词】  黑果枸杞叶片 自由基 抗氧化作用
       Study on Free Radical Scavenging Activity of Methanol Extract from the Leaf of Lycium ruthenicum Murr.
       BAI Hongjin，ZHOU Zhongbo，DU Hongmei，XU Qingpeng
       Xinjiang Production ＆ Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Tarim University ,Alar ,843300，China
       Abstract:ObjectiveTo study the scavenging activiy of the extract from the leaf of Lycium ruthenium Merr. on DPPH free radical, hydroxyl free radical(·OH) and superoxide free radical(O·-  2) ．MethodsThe methods of DPPH·，Salicylic Acid and pyrograllol auto-oxidation were used to assay the scavenging the extract from the leaf of L. rethenicum Murr. on the three free radicals.ResultsThe extract showed good scavenging effect on DPPH·,·OH and O·-  2 under the condition of experiment，and the highest free radical scavenging rate of different free radical were 72.72%，54.90%，92.08% orespecrively.ConclusionThe methanol extract of the leaf of L. rethenicum Murr shows good scavenging effect on DPPH·,·OH and ·O·-  2.
       Key words:Leaf of Lycium ruthenicum Murr；  Free radical；  Antioxidation
       黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.系茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)植物 ，是我国西北地区常见的野生盐生植物，其浆果果实成熟后为圆形，呈深黑色可用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症［1］。其营养成分与宁夏枸杞相似［2］。《维吾尔药志》记载，维吾尔医常用黑果枸杞果实及根皮治疗尿道结石、癣疥、齿龈出血等症，民间作滋补强壮以及降压药［3］。近年来对黑果枸杞的研究主要集中在果实色素方面，对黑果枸杞其它部分的研究较少，关于叶片中的化学成分和生物活性研究未见文献报道。本实验通过体外实验，对黑果枸杞叶片甲醇提取物抗氧化活性进行了初步检测，为黑果枸杞的综合开发利用提供依据。
       1  器材与方法
       1.1  材料
       黑果枸杞叶片于200607采自新疆塔里木盆地，经阴干、粉碎、密封保存。
       1.2  仪器与试剂
       1.2.1  仪器
       SartoriusBS210S 电子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；DHG－9101－2SA型电热恒温鼓风干燥箱；ZP－200振荡器（江苏太仓市实验设备厂）；超纯水仪（美国Millipore公司）；T6-紫外可见分光光度计（北京普析通用有限公司）；centrifuge5415D型离心机（德国艾本德股份公司 （Eppendorf AG））。
       1.2.2  试剂二苯代苦昧酰基自由基(DPPH·)（Sigma公司）；维生素C、维生素E；0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.2，内含2 mmol/L EDTA）、邻苯三酚（60 mmol/L）、甲醇、乙醇、盐酸、H2O2、FeSO4、水杨酸等均为国产分析纯。
       1.3  样品的制备
       称取干燥黑果枸杞叶片100 g，加甲醇2 000 ml，在常温下置于振荡器上（50 r/min）提取2次，24 h/次，过滤，合并滤液，减压浓缩，浓缩液置于50℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥，得供试样品。
       1.4   抗氧化性实验
       1.4.1  样品对DPPH自由基的清除实验DPPH溶液的配制：准确称取7.88 mg DPPH，用无水乙醇溶解并定容于100 ml容量瓶中，DPPH浓度为2×10-4 mo1/l，避光保存(0～4℃)。
        将样品粉末用甲醇配成10 mg/ml溶液，倍比稀释为5，2.5，1.25，0.625 mg/ml溶液。分别取样品溶液2 ml与2×10－4 mol/L DPPH溶液2 ml均匀混合，在黑暗中放置30 min，以甲醇为空白在525 nm处测定其吸光度A，并以下式计算其清除率：
       清除率（%）=［1－（Ai－Aj）/Ac］×100%
       式中：Ac：2 ml甲醇加2 ml DPPH溶液的吸光度；
       Ai：2 ml待测液加2 ml DPPH溶液的吸光度；
       Aj：2 ml待测液加2 ml甲醇的吸光度。
       按照上面公式计算清除率，清除率越大抗氧化能力越强。
       1.4.2 样品对羟自由基的清除实验参照陈留勇等［4］改动的Smirnoff（1989）的水杨酸法，并略作改动。利用H2O2与Fe2＋混合产生羟自由基，即：H2O2＋Fe2＋→·OH＋H2O＋Fe3＋。再在体系中加入水杨酸捕捉羟自由基并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收。用该吸光度值来表示羟自由基的含量。反应体系中含有8.8 mmol/L H2O2 1 ml，9 mmol/l FeSO4 1 ml，9 mmol/L 水杨酸－乙醇 1 ml，待测溶液1 ml，其中H2O2是最后加入并启动整个反应。37℃反应30 min后，12 000 r/min离心6 min，然后以甲醇作参比，在510 nm下测定吸光度。考虑待测溶液本身吸光度的不同，以9 mmol/L FeSO4 1 ml，9 mmol/L 水杨酸－乙醇 1 ml，待测溶液1 ml和甲醇1 ml作为待测溶液的本底吸收值。清除率计算公式为：
       
       清除率（%）＝〔A0－（AX－AX0）〕/A0×100%
         
       其中A0为空白对照液的吸光度，AX为加入待测溶液后的吸光度，AX0为待测溶液的本底吸收值。
       1.4.3 样品对超氧阴离子自由基（O·-  2）的清除实验采用邻苯三酚自氧化法的测定，在试管中按表加入缓冲液和双氧水，于25恒温20 min后加入25℃预热过的邻苯三酚（对照管用10 mmol/L盐酸代替），迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325 nm下每30 s 测定1次吸光度值A。并计算抑制率。抑制率(I%)计算公式为：
       I%=［1-(A3-A4)/(Al-A2 )］×100%
       A1 ：不含样品的吸光度值；
       A2 ：不含样品和邻苯三酚的吸光度值；
       A3 ：含有样品的吸光度值；
       A4 ：含样品，但不含邻苯三酚的吸光度值。
       2  结果
       2.1  样品对DPPH自由基的清除作用按照“1.4.1”项的方法测定样品对DPPH自由基的清除作用，计算其清除率。结果见表1。表1  样品清除DPPH自由基能力的测定样品浓度C/mg·ml-1清除率（略）
       由表1可见，黑果枸杞叶片甲醇提取物对DPPH自由基有较强的清除能力，在浓度为1.25 mg/ml时清除能力最强。
       将样品在同浓度下与维生素C和维生素E清除DPPH自由基能力做比较。结果见表2。表2  不同抗氧化剂清除DPPH自由基的比较（略）
       由表2可见，相同浓度下，黑果枸杞叶片甲醇提取物对DPPH自由基的清除能力强于维生素E，比维生素C稍弱。
       2.2  样品对羟自由基的清除能力结果见表3。表3   样品清除羟自由基能力的测定（略）
       由表3可见，黑果枸杞叶片甲醇提取物对羟自由基有一定的清除能力，且在一定浓度范围内，清除能力与样品浓度成正相关。
       2.3  样品对超氧阴离子自由基的清除能力结果见表4。
       表4  样品清除超氧阴离子自由基（O2ˉ·）能力的测定（略）
       由表4可见，黑果枸杞叶片甲醇提取物对超氧阴离子自由基有较强的清除能力，在一定浓度下清除效果与样品浓度成正相关，且在样品浓度为5 mg/ml时清除能力最强。
       3  讨论
       黑果枸杞叶片甲醇提取物对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基都有清除能力。在一定浓度范围内，黑果枸杞叶片甲醇提取物对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除效果与浓度成正相关，而对DPPH自由基的清除效果与浓度成一定程度的负相关，具体原因尚在进一步研究中。
       现有的研究报道认为糖类、活性肽、活性蛋白质、维生素C、黄酮类化合物等都是优良的的抗氧化剂［5］，而根据本文的实验结果，黑果枸杞叶片甲醇提取物具有一定的清除自由基能力，糖类、肽、蛋白质等都是水溶性成分，供试样品为甲醇提取物，且经盐酸镁粉实验检识表明可能含有黄酮类化合物，因而可初步推断清除自由基的成分可能为黄酮类物质。
       以往对黑果枸杞活性成分的研究仅限于多糖、色素类，且集中在果实方面，对叶片的相关研究未见报道。本文的实验结果表明，黑果枸杞叶片甲醇提取物具有一定清除自由基的能力，拓展了黑果枸杞的药用部位，为黑果枸杞的进一步综合开发提供科学依据。
       【参考文献】
         　　［1］甘青梅，骆利法，李普衍，等. 藏药黑果枸杞开发利用的研究［J］.青海科技，1997，4（1）：17.
       
       ［2］甘青梅. 浅述藏药的研究［J］.中草药，2001，32 (4)：371.
       
       ［3］刘勇民. 维吾尔药志,下［M］.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：484.
       
       ［4］陈留勇，孟宪军，贾 薇，等. 黄桃水溶性多糖的抗肿瘤作用及清除自由基提高免疫活性研究［J］. 食品科学，2004，25（2）：167.
       
       ［5］侯至孝. 自由基相关疾病及抗氧化中药研究［J］.天津药学，1996，8（1）：18.